កែសម្រួលដោយ Peter Sarnow សាលាវេជ្ជសាស្ត្រនៃសាកលវិទ្យាល័យស្ទែនហ្វដ សាកលវិទ្យាល័យស្ទែនហ្វដ រដ្ឋកាលីហ្វ័រញ៉ា បានអនុម័តនៅថ្ងៃទី 25 ខែធ្នូ ឆ្នាំ 2020 (បានពិនិត្យឡើងវិញនៅថ្ងៃទី 25 ខែតុលា ឆ្នាំ 2020)
យើងរាយការណ៍ពីអន្តរកម្មរវាងអនុក្រុមនៅក្នុងការចម្លងនៃស្មុគស្មាញចម្លងមេរោគឆ្លង ដែលមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការចម្លង និងការអភិរក្សការវិវត្ត។យើងបានផ្តល់ភស្តុតាងដែលថាដែន NiRAN ដែលត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹង nsp12 មានសកម្មភាពផ្ទេរសារធាតុ nucleoside monophosphate (NMP) នៅក្នុង trans ហើយបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ nsp9 (ប្រូតេអ៊ីនចង RNA) ជាគោលដៅរបស់វា។NiRAN ជំរុញការភ្ជាប់ covalent នៃ NMP moiety ទៅនឹងស្ថានីយអាមីណូ nsp9 ដែលបានអភិរក្សនៅក្នុងប្រតិកម្មដែលពឹងផ្អែកលើ Mn2+ ions និងសំណល់ Asn ដែលត្រូវបានអភិរក្សនៅជាប់គ្នា។វាត្រូវបានគេរកឃើញថាសកម្មភាព NiRAN និង nsp9 NMPylation គឺចាំបាច់សម្រាប់ការចម្លងមេរោគឆ្លង។ទិន្នន័យអនុញ្ញាតឱ្យយើងភ្ជាប់សកម្មភាពនៃសញ្ញាសម្គាល់អង់ស៊ីមនៃមេរោគដែលបានដាក់សំបុកទៅនឹងការសង្កេតពីមុននៅក្នុងសម្មតិកម្មដែលថាការចាប់ផ្តើមនៃការសំយោគ RNA នៅក្នុងថ្នាក់នៃមេរោគ RNA គឺស្របគ្នានឹងមុខងារ និងការវិវត្តន៍។
RNA-dependent RNA polymerase (RdRps) នៃ Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae និង 12 គ្រួសារផ្សេងទៀត) ត្រូវបានភ្ជាប់ទៅនឹងដែនអាមីណូស្ថានីយ (N-terminal) នៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនដែលមិនមែនជារចនាសម្ព័ន្ធ (nsp) ដែលបញ្ចេញពីប៉ូលីប្រូតេអ៊ីនដែលហៅថា NiRAN 1ab ត្រូវបានផ្សំឡើងដោយប្រូតេអុីនមេរបស់មេរោគ (Mpro)។កាលពីមុន សកម្មភាព GMPylation/UMPylation ផ្ទាល់ខ្លួនរបស់ NiRAN-RdRp nsp នៃមេរោគសរសៃឈាមត្រូវបានរាយការណ៍ ហើយវាត្រូវបានស្នើឱ្យបង្កើតបណ្តោះអាសន្នសម្រាប់ការផ្ទេរ nucleoside monophosphate (NMP) ទៅកាន់មេរោគ (បច្ចុប្បន្នមិនស្គាល់) និង/ឬកោសិកា biopolymerization វត្ថុ។នៅទីនេះ យើងបង្ហាញថា មេរោគ (Human Coronavirus [HCoV]-229E និង Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) មានសកម្មភាព NMPylation ដែលពឹងផ្អែក Mn2+ ដែលកើតចេញពី nsp9 តាមរយៈការបង្កើត Mpro-mediated nsp9 បន្ទាប់ពី N-terminal flanking nsps ត្រូវបានបញ្ចេញដោយ proteolytically phosphoramidate ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ទៅនឹង amine បឋម (N3825) នៅ N-terminal នៃ nsp9 ។Uridine triphosphate គឺជានុយក្លេអូទីតដែលពេញចិត្តក្នុងប្រតិកម្មនេះ ប៉ុន្តែ adenosine triphosphate, guanosine triphosphate និង cytidine triphosphate គឺជាស្រទាប់ខាងក្រោមដែលសមរម្យផងដែរ។ការសិក្សាអំពីការផ្លាស់ប្តូរដោយប្រើប្រាស់ប្រូតេអ៊ីន recombinant coronavirus nsp9 និង nsp12 និងហ្សែន HCoV-229E mutants ដែលបានវិស្វកម្មបានកំណត់សំណល់ដែលចាំបាច់សម្រាប់ NiRAN-mediated nsp9 NMPylation និងការចម្លងមេរោគនៅក្នុងវប្បធម៌កោសិកា។ទិន្នន័យបានបញ្ជាក់ពីការព្យាករណ៍នៃសំណល់គេហទំព័រសកម្ម NiRAN និងកំណត់តួនាទីសំខាន់នៃសំណល់ nsp9 N3826 នៅក្នុង nsp9 NMPylation និងការចម្លងមេរោគនៅក្នុង vitro ។សំណល់នេះគឺជាផ្នែកមួយនៃលំដាប់ N-terminal NNE tripeptide ដែលត្រូវបានអភិរក្ស ហើយបានបង្ហាញថាជាសំណល់អថេរតែមួយគត់នៃ nsp9 និង homologs របស់វានៅក្នុងគ្រួសារមេរោគ។ការសិក្សានេះផ្តល់នូវមូលដ្ឋានគ្រឹះដ៏រឹងមាំសម្រាប់ការសិក្សាមុខងារនៃសកម្មភាព NMPylation នៃមេរោគផ្សេងទៀតដែលដាក់ក្នុងសំបុក និងស្នើនូវគោលដៅដែលអាចកើតមានសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍថ្នាំប្រឆាំងមេរោគ។
មេរោគ Nidovirales positive-stranded RNA ឆ្លងទៅលើពពួកសត្វឆ្អឹងកង និងសត្វមិនមានឆ្អឹងខ្នង (១, ២)។ការបញ្ជាទិញបច្ចុប្បន្នរួមមាន 14 គ្រួសារ (3) ដែលគ្រួសារ Coronavirus ត្រូវបានសិក្សាយ៉ាងទូលំទូលាយក្នុងរយៈពេល 20 ឆ្នាំមុន។នៅពេលនោះ មេរោគ zoonotic 3 កើតចេញពីសត្វពាហនៈ និងបណ្តាលឱ្យមានការផ្ទុះឡើងនៃការឆ្លងមេរោគផ្លូវដង្ហើមធ្ងន់ធ្ងរចំពោះមនុស្ស។រួមទាំងជំងឺរាតត្បាតរ៉ាំរ៉ៃដែលបណ្តាលមកពីជំងឺឆ្លងធ្ងន់ធ្ងរ។រោគសញ្ញាផ្លូវដង្ហើម Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7)។Nidoviruses ចែករំលែកនូវអង្គការហ្សែនទូទៅ ហើយផ្នែករងនៃភ្នាស-ចងចម្លង-ចម្លង-ចម្លងស្មុគស្មាញ (RTC) ត្រូវបានអ៊ិនកូដនៅក្នុងស្ថានីយ 5-?²-terminal ពីរភាគបី និងផ្នែករងរចនាសម្ព័ន្ធសំខាន់នៃភាគល្អិតមេរោគ ក៏ដូចជាគ្រឿងបន្លាស់មួយចំនួនផងដែរ។ .ប្រូតេអ៊ីនដែលបានអ៊ិនកូដនៅក្នុងចុង 3??² ទីបីនៃហ្សែន (1)។លើកលែងតែគ្រួសារមួយនៃមេរោគ Planarian (Monoviridae) (8) មេរោគដែលដាក់សំបុកទាំងអស់បានអ៊ិនកូដអនុរង RTC នៅក្នុងស៊ុមអានបើកចំហធំពីរ (ORF) ORF1a និង ORF1b ដែលត្រូវបានបកប្រែពី RNA ហ្សែននៃ។ORF1a អ៊ិនកូដ polyprotein (pp) 1a ហើយ ORF1a និង ORF1b រួមគ្នាអ៊ិនកូដ pp1ab ។ដោយមានការចូលរួមជាទូទៅនៃ protease មេ (Mpro) ដែលត្រូវបានអ៊ិនកូដដោយ ORF1a ទាំង pp1a និង pp1ab ត្រូវបានដំណើរការ proteolytically ទៅជាប្រូតេអ៊ីនដែលមិនមែនជារចនាសម្ព័ន្ធ (nsps) ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាជា 3CLpro ព្រោះវាមានលក្ខណៈដូចគ្នាជាមួយនឹង 3Cpro នៃមេរោគ picornavirus ( ៩).nsps ទាំងនេះត្រូវបានគេគិតថាត្រូវបានផ្គុំចូលទៅក្នុង RTC ថាមវន្តដ៏ធំមួយដែលជំរុញការសំយោគនៃ RNA ហ្សែន (ការចម្លង) និងសំណុំនៃ RNA subgenomic (ការចម្លង) ហើយត្រូវបានប្រើដើម្បីសំរបសំរួលការបញ្ចេញមតិរបស់ ORF ដែលមានទីតាំងនៅខាងក្រោមនៃ ORF1b (10 ?? ?១២).
ស្នូល RTC រួមមាន RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) និងអង់ស៊ីមកែច្នៃ RNA ជាច្រើន ដែលត្រូវបានអ៊ិនកូដជាចម្បងនៅក្នុង ORF1b និងនៅក្នុងគ្រួសារមេរោគ វាមាន nsp12-nsp16 និង nsp9-nsp12 នៅក្នុងគ្រួសារ Arterioviridae (សូមមើលឯកសារយោង 10ââ 12) ។RdRp និង HEL1 តំណាងឱ្យដែនអភិរក្សចំនួនពីរ (មួយភាគប្រាំ) នៃមេរោគសំបុកបក្សី និងមានលក្ខណៈដូចគ្នាក្នុងចំណោមមេរោគ RNA ផ្សេងទៀត។ការចម្លងស្នូលត្រូវបានគេជឿថាត្រូវបានជួយដោយអនុក្រុមផ្សេងទៀត រួមទាំង nsps តូចៗជាច្រើនដែលបានចេញផ្សាយពីតំបន់ carboxy-terminal (C-terminal) នៃ pp1a, downstream of Mpro (coronavirus nsp5 និង arterial virus nsp4 រៀងគ្នា)។ពួកគេមានកម្រិតការការពារជាក់លាក់សម្រាប់គ្រួសារ និងសកម្មភាពចម្រុះ (បានពិនិត្យនៅក្នុងឯកសារយោង 10ââ12)។
ថ្មីៗនេះ ដែនដែលមានលក្ខណៈតាមលំដាប់លំដោយពិសេសមួយត្រូវបានរកឃើញនៅស្ថានីយអាមីណូ (N-terminus) ដែលនៅជាប់នឹង RdRp នៅក្នុងមេរោគទាំងអស់ដែលមានសំបុក ប៉ុន្តែមិនមានមេរោគ RNA ផ្សេងទៀត (16) ទេ។ដោយផ្អែកលើទីតាំងរបស់វា និងសកម្មភាពរបស់ nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase) ដែននេះត្រូវបានគេហៅថា NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase)។ការរួមបញ្ចូលគ្នានៃដែនពីរនៃ NiRAN-RdRp បង្កើតបានជា nsp12 នៅក្នុងគ្រួសារ Coronaviridae និង nsp9 នៅក្នុងគ្រួសារ Arterioviridae និងនៅក្នុង nestoviridae ផ្សេងទៀត NiRAN-RdRp ត្រូវបានគេរំពឹងថានឹងត្រូវបានបញ្ចេញជា nsp ឯករាជ្យពី polyprotein មេរោគ។នៅក្នុងមេរោគនេះ ដែន NiRAN មានសំណល់ ??1/450 ហើយត្រូវបានភ្ជាប់ទៅដែន C-terminal RdRp តាមរយៈតំបន់តំណភ្ជាប់ (16?19)។នៅក្នុង Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) recombinant nsp9 បង្ហាញពីសកម្មភាព Mn2+ ion-dependent (self) UMPylation និង GMPylation ដែលអាស្រ័យលើមូលដ្ឋានចំនួនបីដែលបានអភិរក្សនៅក្នុង nestovirus, AN, BN និង CN សំណល់នៅក្នុងលំដាប់។កន្លែងដែល N តំណាងឱ្យ NiRAN) (16) ។N-terminal franking នៃ motifs ទាំងនេះគឺជា preAN motif មិនសូវអភិរក្ស។សំណល់ទាំងនេះមួយចំនួនក៏ត្រូវបានអភិរក្សនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីន kinases ដែលទាក់ទងឆ្ងាយផងដែរ ដែលពួកគេត្រូវបានបង្ហាញថាមានជាប់ពាក់ព័ន្ធនឹងការចង nucleoside triphosphate (NTP) និងសកម្មភាពកាតាលីករ (20, 21) ។ស្របតាមការសង្កេតនេះ សំណល់នៃគេហទំព័រសកម្មសំខាន់ៗជាច្រើននៅក្នុង pseudokinase SelO ពី Pseudomonas syringae អាចត្រូវបានប្រមូលផ្តុំជាមួយ supercomplex SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ដែលបានចេញផ្សាយថ្មីៗនេះ។សំណល់ Coronavirus NiRAN ដែលត្រូវបានអភិរក្សដាក់បញ្ចូលក្នុងមីក្រូរចនាសម្ព័ន្ធអេឡិចត្រុង។ប្រូតេអ៊ីនផ្សំឡើងវិញ (17) ។វាត្រូវបានគេប៉ាន់ស្មានថា U/GMPylation ដែលបានចងក្រងជាឯកសារ (ដោយខ្លួនឯង) នឹងបង្កើតស្ថានភាពបណ្តោះអាសន្នដើម្បីផ្ទេរ NMP ទៅស្រទាប់ខាងក្រោម (16) ហើយភាពស្រដៀងគ្នានៃរចនាសម្ព័ន្ធរវាង NiRAN និងប្រូតេអ៊ីន kinase (17, 19) គឺជាសម្មតិកម្មដែលថា NiRAN កែប្រែប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀត។
លក្ខណៈពិសេសជាច្រើន រួមទាំងការផ្សារភ្ជាប់គ្នាជាប្រព័ន្ធតែមួយគត់ និងពិសេសរបស់វាជាមួយមេរោគសំបុក និងការបំបែកហ្សែនពី RdRp ធ្វើឱ្យ NiRAN ជាអង់ស៊ីមនិយតកម្មគន្លឹះដ៏សមហេតុផលសម្រាប់មេរោគសំបុក ដែលមានសារៈសំខាន់ចំពោះការលេចឡើង និងអត្តសញ្ញាណរបស់ពួកគេ។ពីមុន មុខងារបីដែលអាចធ្វើទៅបានដែលពាក់ព័ន្ធនឹង NiRAN ដើម្បីគ្រប់គ្រងហ្សែន/ការបកប្រែ subgenomic ឬការចម្លង/ការចម្លងត្រូវបានគេហៅថា។នៅពេលពិចារណាលើទិន្នន័យខ្វះខាត និងមិនពេញលេញដែលមាននៅពេលនោះ មុខងារនីមួយៗមានគុណសម្បត្តិ និងគុណវិបត្តិរបស់វា (16)។នៅក្នុងការស្រាវជ្រាវនេះ យើងមានគោលបំណងបញ្ចូលគ្នានូវការសិក្សាជីវគីមី និងហ្សែនបញ្ច្រាសនៃមេរោគឆ្លងដែលតំណាងឱ្យហ្សែនទាំងពីរ ហើយដាក់ការរកឃើញរបស់យើងនៅក្នុងប្រវត្តិនៃការវិវត្តន៍នៃការផ្លាស់ប្តូរធម្មជាតិនៃក្រុមគ្រួសារនៃមេរោគនេះ ដើម្បីទទួលបានការយល់ដឹងពីអាណាចក្រដ៏អាថ៌កំបាំងនេះ។យើងរាយការណ៍ពីភាពជឿនលឿនសំខាន់ៗក្នុងការយល់ដឹងអំពី NiRAN តាមរយៈការកំណត់អត្តសញ្ញាណគោលដៅធម្មជាតិនៅក្នុង RTC ដែល (ក្នុងចំណោមសម្មតិកម្មទាំងបីដែលមាន) រួមចំណែកដល់តួនាទីនៃដែននេះក្នុងការផ្តួចផ្តើមការសំយោគនៃ RNA មេរោគដែលជាប់គាំង។ការស្រាវជ្រាវនេះក៏បើកលទ្ធភាពសម្រាប់តួនាទីផ្សេងទៀតរបស់ NiRAN នៅលើចំណុចប្រទាក់ម៉ាស៊ីនមេរោគ។
ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈនៃលក្ខណៈសម្បត្តិអង់ស៊ីមនៃដែន NiRAN ដែលទាក់ទងនឹងមេរោគ corona nsp12 យើងបានផលិតទម្រង់ផ្សំឡើងវិញនៃមេរោគរបស់មនុស្ស 229E (HCoV-229E) nsp12 នៅក្នុង E. coli ដោយមានស្លាក His6 នៅស្ថានីយ C និងរួមបញ្ចូលគ្នា។ ប្រូតេអ៊ីនជាមួយ [α32-P] Incubate រួមគ្នាជាមួយ NTP នៅក្នុងវត្តមានរបស់ MnCl2 ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត។ការវិភាគនៃផលិតផលប្រតិកម្មបានបង្ហាញពីវត្តមានរបស់ប្រូតេអ៊ីន radiolabelated ធ្វើចំណាកស្រុកជាមួយ nsp12 (106 kDa) ដែលបង្ហាញថាមេរោគ nsp12 ជំរុញការបង្កើតប្រូតេអ៊ីន covalent-NMP adducts ដែលបង្កើតជាអនុគ្រោះជាមួយ uridine monophosphate (UMP) (រូបភាព 1A) និង ខ).ការវិភាគបរិមាណបានបង្ហាញថាបើប្រៀបធៀបជាមួយនុយក្លេអូទីតផ្សេងទៀត អាំងតង់ស៊ីតេនៃសញ្ញានៃការបញ្ចូល UMP បានកើនឡើងពី 2 ទៅ 3 ដង (រូបភាព 1C) ។ទិន្នន័យនេះគឺស្របទៅនឹងសកម្មភាពផ្ទេរ NMP ដែលបានព្យាករណ៍នៃដែន NiRAN នៃមេរោគកូរ៉ូណា (16) ប៉ុន្តែបង្ហាញថា ចំណូលចិត្តនុយក្លេអូទីតនៃដែន NiRAN នៃមេរោគកូវីដ-១៩ និងវីរុសសរសៃឈាមគឺខុសគ្នា។
សកម្មភាព NMPylation ដោយខ្លួនឯងនៃ HCoV-229E nsp12 ។(ក) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) ត្រូវបាន incubated ជាមួយ [α-32P] NTP ដែលបានកំណត់ក្នុងវត្តមាន 6 mM MnCl2 រយៈពេល 30 នាទី (សូមមើលសម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្តសម្រាប់ព័ត៌មានលម្អិត)។ផលិតផលប្រតិកម្មត្រូវបានបំបែកដោយ SDS-PAGE និងប្រឡាក់ដោយ Coomassie ពណ៌ខៀវដ៏អស្ចារ្យ។(ខ) ប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាកវិទ្យុសកម្មត្រូវបានមើលឃើញដោយរូបភាពផូស្វ័រ។ទីតាំងនៃ nsp12-His6 និងសញ្ញាសម្គាល់ម៉ាស់ម៉ូលេគុលប្រូតេអ៊ីន (គិតជាគីឡូដាល់តុន) ត្រូវបានបង្ហាញក្នុង A និង B. (C) អាំងតង់ស៊ីតេនៃសញ្ញាវិទ្យុសកម្ម (មធ្យម ± SEM) ត្រូវបានកំណត់ពីការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបី។*P≤0.05។ភាពខ្លាំងនៃសញ្ញា (ភាគរយ) គឺទាក់ទងទៅនឹង UTP ។
ទោះបីជាសកម្មភាពអង់ស៊ីមដែលទាក់ទងនឹង NiRAN ត្រូវបានបង្ហាញថាមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការចម្លង EAV និង SARS-CoV នៅក្នុងវប្បធម៌កោសិកា (16) ក៏ដោយ ក៏មុខងារ NiRAN ជាក់លាក់ និងគោលដៅសក្តានុពលមិនទាន់ត្រូវបានកំណត់នៅឡើយ។ភាពស្រដៀងគ្នានៃរចនាសម្ព័ន្ធដែលបានរាយការណ៍ថ្មីៗនេះរវាង NiRAN និងក្រុមគ្រួសារនៃប្រូតេអ៊ីនដែលមានផ្នត់ដូចប្រូតេអ៊ីន (17, 22) បានជំរុញឱ្យយើងសាកល្បងសម្មតិកម្មដែល NiRAN ជំរុញ NMPylation នៃប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀត។យើងបានបង្កើតសំណុំនៃគោលដៅដូចគ្នាដែលមានសក្តានុពល រួមទាំងប្រូតេអ៊ីនដែលមិនមែនជារចនាសម្ព័ន្ធដែលត្រូវបានអ៊ិនកូដដោយ HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) ដែលនីមួយៗមានស្លាក His6 ស្ថានីយ C (ឧបសម្ព័ន្ធ SI តារាង S1) និង បង្កាត់ប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះជាមួយ [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) នៅក្នុងវត្តមាន ឬអវត្តមាននៃ nsp12។Bovine serum albumin និង MBP-LacZα fusion protein ដែលផលិតនៅក្នុង E. coli បម្រើជាការគ្រប់គ្រង (រូបភាព 2A, ផ្លូវលេខ 1 ដល់ 7)។ប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាកសញ្ញាវិទ្យុសកម្មត្រូវបានវិភាគដោយសូដ្យូម dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) និង autoradiography ហើយវាត្រូវបានគេរកឃើញថាមានសញ្ញាវិទ្យុសកម្មខ្លាំងនៅក្នុងប្រតិកម្មដែលមានផ្ទុក nsp12 និង nsp9 ។ទីតាំងនៃសញ្ញាត្រូវគ្នាទៅនឹងម៉ាស់ម៉ូលេគុលនៃ nsp9 ដែលបង្ហាញពី Nsp12-mediated UMPylation នៃ nsp9 (រូបភាព 2B, បទ 7)។គ្មានប្រូតេអ៊ីនធ្វើតេស្តផ្សេងទៀតត្រូវបានគេរកឃើញថាត្រូវបាន UMPylated ដែលនាំឱ្យយើងសន្និដ្ឋានថា nsp9 គឺជាស្រទាប់ខាងក្រោមជាក់លាក់នៃ nsp12 ។ដោយអនុលោមតាមទិន្នន័យ NMPylation ដោយខ្លួនឯងដែលបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 1, nsp12 អាចផ្ទេរ NMPs ទាំងបួនទៅ nsp9 ទោះបីជាប្រសិទ្ធភាពខុសគ្នាក៏ដោយ UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ( រូបភាព)។3 A និង B) ។នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌដែលបានប្រើនៅក្នុងការវិភាគនេះ (កាត់បន្ថយប្រតិកម្ម និងពេលវេលានៃការប៉ះពាល់ កាត់បន្ថយកំហាប់នៃ nsp12; សម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត) មិនអាចរកឃើញដោយខ្លួនឯង NMPylation នៃ nsp12 (ប្រៀបធៀបរូបភាពទី 2B ផ្លូវលេខ 7 និងរូបភាពទី 1B) ដែល បានបង្ហាញពីប្រសិទ្ធភាព (និងច្រើនជុំ) UMP បានផ្លាស់ប្តូរពី nsp12 ទៅ nsp9។សកម្មភាព UMP transferase តម្រូវឱ្យមានវត្តមានរបស់ Mn2+ ions ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 3C ខណៈពេលដែលសកម្មភាព UMP transferase តិចតួចបំផុតត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងវត្តមាននៃ Mg2+ ហើយគ្មានសកម្មភាពណាមួយនៅក្នុងវត្តមាននៃ cation divalent ពីរផ្សេងទៀតដែលត្រូវបានសាកល្បងនោះទេ។ទិន្នន័យស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានទទួលនៅក្នុងការវិភាគ NMPylation ដែលមានផ្ទុក cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP) និង adenosine triphosphate (ATP) (SI appendix, Figure S1)។
HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation នៃ nsp9 ។ស៊េរីនៃស្រទាប់ខាងក្រោមប្រូតេអ៊ីន (រួមទាំងអាល់ប៊ុមសេរ៉ូម bovine MBP-lacZα និងស៊េរីនៃ HCoV-229E nsps ដែលមានស្លាកសញ្ញា C-terminal His6 ដែលត្រូវបានអ៊ិនកូដដោយ ORF1a) ត្រូវបានប្រើដើម្បីវាយតម្លៃសកម្មភាព UMPylation នៃ HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated ប្រូតេអ៊ីន។បង្កាត់ប្រូតេអ៊ីនជាមួយ [α-32P] UTP រយៈពេល 10 នាទីក្នុងអវត្តមាន (A) ឬវត្តមាន (B) នៃ nsp12 ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត។នៅផ្នែកខាងលើនៃ A និង B, SDS-polyacrylamide gel ប្រឡាក់ដោយ Coomassie Brilliant Blue ត្រូវបានបង្ហាញ ហើយនៅផ្នែកខាងក្រោមនៃ A និង B, autoradiograms ដែលត្រូវគ្នាត្រូវបានបង្ហាញ។ទីតាំងនៃសញ្ញាសម្គាល់ម៉ាស់ម៉ូលេគុលប្រូតេអ៊ីន (គិតជាគីឡូដាល់តុន) ត្រូវបានផ្តល់ឱ្យនៅខាងឆ្វេង។ទីតាំងនៃ nsp12-His6 (B, កំពូល) និងសញ្ញាវិទ្យុសកម្មដែលបានសង្កេតក្នុងអំឡុងពេល incubation នៃ nsp12-His6 ជាមួយ nsp9-His6 (B, lane 7) ក៏ត្រូវបានចង្អុលបង្ហាញផងដែរ ដែលបង្ហាញថា [α-32P]UMP ទៅ nsp9-His6 (12.9 kDa) ដែលមិនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀតដែលត្រូវបានធ្វើតេស្ត។
HCoV-229E NiRAN-សម្របសម្រួលជីវគីមី និងលក្ខណៈមេរោគនៃ nsp9 NMPylation ។(A និង B) តួនាទីរបស់ nucleotide co-substrate ដែលប្រើក្នុងប្រតិកម្ម។Nsp12-His6 និង nsp9-His6 ត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នា និងភ្ញាស់នៅក្នុងវត្តមាននៃ [α-32P] NTPs ខុសៗគ្នានៅក្នុងការធ្វើតេស្ត NMPylation ស្តង់ដារ។(A, top) Coomassie-stained nsp9-His6 បំបែកដោយ SDS-PAGE ។(A, បាត) Autoradiograph នៃតំបន់ដូចគ្នានៃជែល។(ខ) សកម្មភាពទាក់ទង (មធ្យម ± SEM) នៅក្នុងវត្តមាននៃ cofactor nucleotide ដែលបានកំណត់ត្រូវបានកំណត់ពីការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបី។*P≤0.05។(គ) តួនាទីរបស់អ៊ីយ៉ុងដែក។បានបង្ហាញគឺជាការធ្វើតេស្ត NMPylation ស្តង់ដារនៅក្នុងវត្តមាននៃ [α-32P] UTP និងអ៊ីយ៉ុងដែកផ្សេងគ្នាដែលនីមួយៗមានកំហាប់ 1 mM ។នៅក្នុង C ផ្នែកខាងលើ Coomassie ប្រឡាក់ nsp9-His6 ត្រូវបានបង្ហាញ ហើយនៅក្នុង C ខាងក្រោម autoradiography ដែលត្រូវគ្នាត្រូវបានបង្ហាញ។ទំហំនៃប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាក (គិតជាគីឡូដាល់តោន) ត្រូវបានបង្ហាញនៅខាងឆ្វេងនៃ A និង C. (D) ទម្រង់ផ្លាស់ប្តូរនៃ HCoV-229E nsp12-His6 ដែលផ្ទុកការជំនួសអាស៊ីតអាមីណូដែលបានបញ្ជាក់គឺនៅក្នុង [α-32P]UTP ដូចដែលបានពិពណ៌នា នៅក្នុងសម្ភារៈនិងវិធីសាស្រ្ត។កាំរស្មី nsp9-His6 ដែលផលិតក្នុងប្រតិកម្ម NMPylation ត្រូវបានរកឃើញដោយការថតរូបភាព phosphorylation (D, top) ។សកម្មភាពដែលទាក់ទងធៀបនឹងប្រូតេអ៊ីនប្រភេទសត្វព្រៃ (wt) ត្រូវបានបង្ហាញជា D ហើយបាតត្រូវបានគេយកជាមធ្យម (±SEM) ពីការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបី។សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីការជំនួសសំណល់ដែលមិនរក្សាទុក។(ង) មេរោគ titer នៅក្នុងកោសិកាវប្បធម៍ខ្ពស់នៃកោសិកា p1 ដែលទទួលបាន 24 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការឆ្លងត្រូវបានកំណត់ដោយការវិភាគបន្ទះ។ការជំនួស codon នៅក្នុងដែន NiRAN នៃវិស្វកម្ម HCoV-229E mutant ត្រូវបានចង្អុលបង្ហាញ (លេខសំណល់គឺផ្អែកលើទីតាំងរបស់ពួកគេនៅក្នុង pp1ab) ។គេហទំព័រសកម្ម RdRp ដែលគ្មានការចម្លងឡើងវិញ nsp12_DD4823/4AA ត្រូវបានប្រើជាវត្ថុបញ្ជា។
ដើម្បីទទួលបានការយល់ដឹងកាន់តែស៊ីជម្រៅអំពីទីតាំងសកម្មរបស់ NiRAN និងកំណត់សំណល់ដែលទាក់ទងទៅនឹងសកម្មភាពនៃ NMP transferase ជាក់លាក់ nsp9 យើងបានធ្វើការវិភាគការផ្លាស់ប្តូរ ដែលក្នុងនោះយើងបានជំនួសសំណល់អភិរក្សនៅក្នុងគំនូរ NiRAN AN, BN និង CN ( 16) វាគឺជា Ala (SI appendix, រូបភាព S2) ។លើសពីនេះទៀតផលប៉ះពាល់នៃការជំនួស Arg-to-Lys ឬ Lys-to-Arg ត្រូវបានវាយតម្លៃក្នុងករណីពីរ។ក្នុងនាមជាការគ្រប់គ្រង (អវិជ្ជមាន) សំណល់ដែលមិនត្រូវបានអភិរក្ស ឬតិចជាងនៅក្នុងដែន NiRAN នៃមេរោគឆ្លង និងមេរោគដែលមានសំបុកផ្សេងទៀតត្រូវបានជំនួសដោយ Ala ។ ការជំនួស K4116A (នៅក្នុង motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (គំនូរ BN) និង D4280A (CN) កាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំង ឬសូម្បីតែលុបបំបាត់ nsp9 NMPylation តាមរយៈ nsp12 ខណៈពេលដែលប្រូតេអ៊ីនជាមួយនឹងការជំនួសបែបអភិរក្ស (R4178K), K4116R) រក្សាបាន 60% និង 80% នៃសកម្មភាពរបស់ពួកគេ ដែលបង្ហាញថាការបន្ធូរបន្ថយការរឹតបន្តឹងលើផ្នែករៀងៗខ្លួន។ ខ្សែសង្វាក់គឺប្រកាន់អក្សរតូចធំ (រូបភាព 3D) ។ការជំនួសសំណល់ដែលបានរក្សាទុកផ្សេងទៀតជាច្រើន E4145A, D4273A, F4281A និង D4283A គឺមិនសូវមានគ្រោះថ្នាក់ទេ ហើយ nsp9 UMPylation ត្រូវបានកាត់បន្ថយកម្រិតមធ្យមប៉ុណ្ណោះ។លទ្ធផលស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេទទួលបាននៅក្នុងប្រតិកម្ម nsp9 NMPylation ដែលពាក់ព័ន្ធនឹង NTPs ផ្សេងទៀត (រូបភាពទី 3D និង SI ឧបសម្ព័ន្ធរូបភាព S3) ដោយបញ្ជាក់ថាផលប៉ះពាល់ដែលបានសង្កេតឃើញលើការជំនួសអាស៊ីតអាមីណូជាក់លាក់គឺឯករាជ្យនៃប្រភេទនៃសហស្រទាប់ខាងក្រោមនុយក្លេអូទីតដែលបានប្រើ។បន្ទាប់មក យើងបានសាកល្បងផលប៉ះពាល់ដែលអាចកើតមាននៃការជំនួស nsp12 ទាំងនេះលើការចម្លងនៃមេរោគឆ្លងនៅក្នុងកោសិកាវប្បធម៌។ដល់ទីបញ្ចប់នេះ យើងបានប្រើគំរូ DNA បន្ថែម (cDNA) ដែលត្រូវបានបង្កើតដោយវិស្វកម្មហ្សែនសមស្របដែលត្រូវបានក្លូននៅក្នុងវីរុសវ៉ាក់សាំងផ្សំឡើងវិញ (23, 24) ដើម្បីចម្លងកោសិកា 5 -7 ។Titration នៃមេរោគឆ្លងដែលផលិតនៅក្នុងកោសិកាទាំងនេះបានបង្ហាញថា មេរោគ HCoV-229E NiRAN ភាគច្រើនមិនអាចធ្វើទៅបានទេ (រូបភាពទី 3E)។ក្រុមនៃសារធាតុបំប្លែងមេរោគដែលមិនអាចទៅរួចរួមមានជម្រើសដែលត្រូវបានបង្ហាញដើម្បីលុបបំបាត់ ឬកាត់បន្ថយសកម្មភាព NMP transferase យ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) ប៉ុន្តែមានជម្រើសពីរផ្សេងទៀត (K4116R, E4805A) % បម្រុង?សកម្មភាព NMPylation in vitro របស់ពួកគេបង្ហាញថាមានការរឹតបន្តឹងបន្ថែម។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការផ្លាស់ប្តូរពីរផ្សេងទៀត (R4178K, F4281A) ដែលបណ្តាលឱ្យមានការថយចុះកម្រិតមធ្យមនៃសកម្មភាព NMPylation របស់ NiRAN នៅក្នុង vitro NMPylation បានផលិតមេរោគបន្តផ្ទាល់ ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មេរោគទាំងនេះបានកាត់បន្ថយចំនួន titers យ៉ាងខ្លាំងតាមរយៈការចម្លង។អនុលោមតាមទិន្នន័យសកម្មភាព in vitro ដែលបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 3D ដោយជំនួសសំណល់ចំនួន 4 ផ្សេងទៀតដែលមិនត្រូវបានអភិរក្សនៅក្នុងមេរោគឆ្លង និង/ឬមេរោគដែលមានសំបុកផ្សេងទៀត (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) បានផលិតមេរោគដែលអាចកើតមានដល់កូនចៅ ទោះបីជាមាន ការបន្ថយកម្រិតមធ្យមធៀបនឹងមេរោគប្រភេទព្រៃ (រូបភាពទី 3E)។
ដើម្បីសិក្សាថាតើសកម្មភាពផ្ទេរ NMP ដែលសម្របសម្រួលដោយ NiRAN អាស្រ័យលើដែន RdRp សកម្ម សំណល់ Asp ដែលបានរក្សាទុកពីរដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការសម្របសម្រួលនៃអ៊ីយ៉ុងដែក divalent (11) នៅក្នុង RdRp motif C ត្រូវបានជំនួសដោយអាឡា។ ប្រូតេអ៊ីនលទ្ធផល nsp12_DD4823/4AA រក្សា សកម្មភាព nsp9 NMPylation របស់វាដែលបង្ហាញថាសកម្មភាព nsp12-សម្របសម្រួលនៅក្នុង vitro nsp9 NMPylation មិនត្រូវការសកម្មភាពប៉ូលីមែរទេ (SI ឧបសម្ព័ន្ធរូបភាព S4) ។
បន្ទាប់ពីបានបង្កើតសកម្មភាព NMP transferase ជាក់លាក់ nsp9 សម្រាប់ nsp12 យើងបានព្យាយាមកំណត់លក្ខណៈនៃ NMP-nsp9 adduct ដោយម៉ាស់ spectrometry (MS) ។វិសាលគមប្រូតេអ៊ីនពេញលេញនៃ HCoV-229E nsp9 ដែលផ្សំឡើងវិញបានបង្ហាញពីកម្រិតខ្ពស់បំផុតនៅ 12,045 Da (រូបភាព 4A) ។ការបន្ថែមនៃ nsp12 មិនបានផ្លាស់ប្តូរគុណភាពនៃ nsp9 ដែលបង្ហាញថា nsp12 និង nsp9 នឹងមិនបង្កើតស្មុគស្មាញដែលមានស្ថេរភាពនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌដែលបានប្រើ (denaturation) (រូបភាព 4A) ។នៅក្នុងវត្តមាននៃ UTP និង GTP ការវាស់វែងម៉ាស់នៃប្រតិកម្មដែលមាន nsp9 និង nsp12 រៀងគ្នាបានបង្ហាញថាម៉ាស់ប្រូតេអ៊ីនរបស់ UTP បានផ្លាស់ប្តូរ 306 Da ហើយម៉ាស់ប្រូតេអ៊ីនរបស់ GTP បានផ្លាស់ប្តូរ 345 Da ដែលបង្ហាញថាម៉ូលេគុល nsp9 នីមួយៗចង UMP ឬ GMP (រូបភាពទី 4) C និង D) ។វាត្រូវបានគេប៉ាន់ស្មានថាថាមពលដែលត្រូវការសម្រាប់ NiRAN-mediated nsp9 NMPylation មកពី NTP hydrolysis និងការបញ្ចេញ pyrophosphate ។ថ្វីបើ 10 ដងនៃ molar លើសពី nsp9 (គោលដៅ) ជាង nsp12 (អង់ស៊ីម) ត្រូវបានប្រើក្នុងប្រតិកម្មនេះ ស្ទើរតែពេញលេញ NMPylation នៃ nsp9 ត្រូវបានអង្កេត ដែលបង្ហាញថាអន្តរកម្មរវាង nsp12 និង nsp9 គឺមានរយៈពេលខ្លី ហើយ nsp12 អាច NMPylate ច្រើនជាង nsp9 ម៉ូលេគុល in vitro ។
NMPylation តែមួយនៃ nsp9 នៅក្នុងវត្តមាននៃ nsp12 និង UTP ឬ GTP ។បង្ហាញគឺជាវិសាលគមប្រូតេអ៊ីនពេញលេញដែលត្រូវបានរំលាយចោលនៃ HCoV-229E nsp9 (SI appendix, Table S1) (AD) ។(A) nsp9 តែម្នាក់ឯង, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 នៅក្នុងវត្តមានរបស់ UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 នៅក្នុងវត្តមានរបស់ GTP ។
ដើម្បីកំណត់សំណល់ nsp9 UMPylated ដោយ nsp12, nsp9-UMP ត្រូវបានកាត់ដោយ trypsin ។peptides លទ្ធផលត្រូវបានបំបែកដោយ nano-high performance liquid chromatography (HPLC) និងវិភាគដោយ tandem mass spectrometry (MS/MS) តាមអ៊ីនធឺណិត។ការវិភាគទិន្នន័យដោយប្រើកញ្ចប់កម្មវិធី Byonic (Protein Metrics) បានបង្ហាញ UMPylation នៃ N-terminal amino acid ។នេះត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយដៃ។វិសាលគមនៃម៉ាស់ tandem នៃ precursor peptide [UMP]NNEIMPGK (SI appendix, Figure S5A) បានបង្ហាញបំណែកនៅ 421 m/z ដែលបង្ហាញថា UMP ភ្ជាប់ទៅនឹងសំណល់ 1 នៃ nsp9 ។
នៅ N-terminus នៃ nsp9, Asn ត្រូវបានអភិរក្សក្នុងចំណោមសមាជិកនៃ Orthocoronavirinae (SI appendix, រូបភាព S6) ។ទោះបីជាយើងជឿថា N-terminal primary amine nitrogen គឺជាអ្នកទទួលយកដែលទំនងបំផុតសម្រាប់ UMP ក៏ដោយ យើងបានសម្រេចចិត្តដើម្បីទទួលបានភស្តុតាងបន្ថែមនៃការចង NMP នៅ N-terminal ។សម្រាប់ហេតុផលនេះ អាស៊ីត NMPylated និង NMPylated N-terminal peptide nsp9 ដែលត្រូវបានបន្សុតដោយ HPLC ទទួលបាននៅក្នុងវត្តមាននៃ acetone និង sodium cyanoborohydride ។នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌទាំងនេះ មានតែអាមីណូបឋមឥតគិតថ្លៃប៉ុណ្ណោះដែលអាចកែប្រែបានដោយប្រើ propyl (25)។N-terminal nsp9-derived peptide ជាមួយនឹងលំដាប់ NNEIMPGK មានអាមីណូបឋមពីរ ដែលមួយនៅ N-terminus នៃ Asn និងមួយទៀតនៅខ្សែសង្វាក់ចំហៀងនៃ Lys នៅ C-terminus ។ដូច្នេះក្រុម propyl អាចត្រូវបានណែនាំនៅចុងទាំងពីរ។ក្រូម៉ាតូក្រាមអ៊ីយ៉ុងដែលបានស្រង់ចេញនៃ peptides មិនមែន NMPylated ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងឧបសម្ព័ន្ធ SI រូបភាព S5B ។ដូចដែលបានរំពឹងទុក N-terminal និង C-terminal (mono)propylated (SI appendix, រូបភាព S5B, upper lane) និង dipropylated peptides (SI appendix, Figure S5B, lower lane) អាចត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ។គំរូនេះផ្លាស់ប្តូរជាមួយនឹងការប្រើប្រាស់ NMPylated N-terminal peptide នៃ nsp9 ។ក្នុងករណីនេះ មានតែ peptides propylated ស្ថានីយ C អាចត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ ប៉ុន្តែ N-terminal propylated peptides និង dipropylated peptides មិនត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណទេ (SI Appendix, Figure S5C) ដែលបង្ហាញថា UMP ត្រូវបានផ្ទេរទៅ N-terminal primary amine ដើម្បីការពារបញ្ហានេះ។ ក្រុមពីការផ្លាស់ប្តូរ។
បន្ទាប់មក យើងជំនួស (ជាមួយ Ala ឬ Ser) ឬលុបសំណល់ដែលបានរក្សាទុកនៅ N-terminus នៃ nsp9 ដើម្បីកំណត់ឧបសគ្គជាក់លាក់គោលដៅ។ដោយផ្អែកលើទិន្នន័យ MS របស់យើងដែលបង្ហាញថា NiRAN បង្កើតជា adduct nsp9-NMP ជាមួយនឹងអាមីណូចម្បងនៃសំណល់ N-terminal residue នៃ nsp9 យើងបានសន្មត់ថា nsp9 NMPylation ត្រូវការប្រូតេស៊ីមេនៃមេរោគ (Mpro, nsp5) ដើម្បីបញ្ចេញ nsp9 N-terminal ពី សារធាតុ polyprotein របស់វា។ដើម្បីសាកល្បងសម្មតិកម្មនេះ យើងផលិតប្រូតេអ៊ីនមុនគេ nsp7-11 ដែលមាន nsp9 នៅក្នុង E. coli ហើយបានធ្វើតេស្តស្តង់ដារ NMPylation ក្នុងវត្តមាន [α-32P] UTP (សម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត)។ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 5A (ផ្លូវទី 3) មុនគេ nsp7-11 ដែលមិនកាត់មិនត្រូវបានដាក់ស្លាកវិទ្យុសកម្មជាមួយ nsp12 ទេ។ផ្ទុយទៅវិញ ប្រសិនបើ nsp7-11 ត្រូវបានបំបែកដោយ nsp5 recombinant ដើម្បីបញ្ចេញ nsp9 (និង nsps ផ្សេងទៀត) ពីមុន នោះប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាកវិទ្យុសកម្មដែលធ្វើចំណាកស្រុកជាមួយ nsp9 ត្រូវបានរកឃើញ ដោយបញ្ជាក់ពីការសន្និដ្ឋានរបស់យើងថា NiRAN និង N- ការបង្កើតជ្រើសរើសនៃ nsp9-NMP adducts .អាមីនបឋមនៃស្ថានីយ N-terminal Asn (ទីតាំង 3825 ក្នុង pp1a/pp1ab)។ការសន្និដ្ឋាននេះក៏ត្រូវបានគាំទ្រដោយការពិសោធន៍ដោយប្រើ nsp9 construct ដែលមានសំណល់បន្ថែមមួយឬពីរនៅ N-terminus ។ក្នុងករណីទាំងពីរ UMPylation ដែលសម្របសម្រួលដោយ NiRAN នៃ nsp9 ត្រូវបានលុបចោល (SI Appendix, រូបភាព S7)។បន្ទាប់មក យើងផលិតប្រូតេអ៊ីនដែលមានសំណល់ Asn មួយឬពីរដែលត្រូវបានលុបចេញពីលំដាប់ peptide 3825-NNEIMPK-3832 នៅស្ថានីយ N នៃ nsp9 ។ក្នុងករណីទាំងពីរនេះ nsp9 UMPylation ត្រូវបានរារាំងទាំងស្រុង (រូបភាព 5B) ដោយផ្តល់នូវភស្តុតាងបន្ថែមថា nsp9 N-terminus ពិតប្រាកដដើរតួជាអ្នកទទួល NMP ។
ដំណើរការ proteolytic នៃ nsp9 និងតួនាទីនៃសំណល់ N-terminal នៅក្នុង nsp12-mediated UMPylation ។(A) nsp9 UMPylation តម្រូវឱ្យមាន nsp9 N-terminal ឥតគិតថ្លៃ។Nsp7-11-His6 ត្រូវបាន incubated ជាមុននៅ 30 ° C នៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្នការរកឃើញ NMPylation ដែលមាន UTP នៅក្នុងវត្តមាន ឬអវត្តមាននៃ Mpro recombinant (nsp5-His6) ។បន្ទាប់ពី 3 ម៉ោង ចាប់ផ្តើមការវិភាគ NMPylation ដោយបន្ថែម nsp12-His6 ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត។ប្រតិកម្មដែលមាន nsp5-His6 (lane 1) និង nsp9-His6 (lane 2) ត្រូវបានគេប្រើជាការគ្រប់គ្រង។បន្ទាប់ពី 10 នាទីប្រតិកម្មត្រូវបានបញ្ចប់ហើយល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានបំបែកដោយ SDS-PAGE ។ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានប្រឡាក់ដោយ Coomassie Brilliant Blue (A, top) ។មុនគេ Nsp7-11-His6 និងផលិតផលដែលបានដំណើរការដែលកើតចេញពីការបំបែកដែលបានសម្របសម្រួល nsp5-His6 ត្រូវបានបង្ហាញនៅខាងស្តាំ។សូមចំណាំ (ដោយសារតែទំហំតូចរបស់វា) ដែល nsp7 និង nsp11-His6 មិនអាចរកឃើញនៅក្នុងជែលនេះ ហើយប្រតិកម្មត្រូវបានបន្ថែមដោយ nsp5-His6 (ផ្លូវលេខ 1 និង 4 ទីតាំងនៃ nsp5-His6 ត្រូវបានចង្អុលបង្ហាញដោយរង្វង់រឹង) ឬ nsp9-His6 (ផ្លូវទី 2) មានផ្ទុក MBP មួយចំនួនតូច (បង្ហាញដោយរង្វង់បើកចំហ) ជាសារធាតុមិនបរិសុទ្ធដែលនៅសេសសល់ ដោយសារពួកវាត្រូវបានបង្ហាញជាប្រូតេអ៊ីនលាយ MBP (SI appendix, Table S1) ។(ខ) វ៉ារ្យ៉ង់ Nsp9-His6 ខ្វះសំណល់ N-terminal Asn មួយឬពីរ (សំណល់លេខយោងទៅតាមទីតាំងនៅក្នុង pp1a/pp1ab) ហើយត្រូវបានបន្សុត និងបង្កាត់ជាមួយ nsp12-His6 និង [α-32P] UTP ។B, SDS-PAGE ប្រឡាក់ជាមួយ Coomassie ត្រូវបានបង្ហាញនៅផ្នែកខាងលើ B, autoradiograph ដែលត្រូវគ្នាត្រូវបានបង្ហាញនៅខាងក្រោម។ទីតាំងនៃសញ្ញាសម្គាល់ទម្ងន់ម៉ូលេគុល (គិតជាគីឡូដាល់តោន) ត្រូវបានបង្ហាញនៅខាងឆ្វេង។(C) សំណល់ដែលបានរក្សាទុកនៅស្ថានីយ HCoV-229E nsp9-His6 N ត្រូវបានជំនួសដោយ Ala ឬ Ser ហើយបរិមាណប្រូតេអ៊ីនដូចគ្នាត្រូវបានគេប្រើនៅក្នុងប្រតិកម្ម UMPylation សម្របសម្រួល nsp12-His6 ។ផលិតផលប្រតិកម្មត្រូវបានបំបែកដោយ SDS-PAGE ហើយប្រឡាក់ដោយ Coomassie Brilliant Blue (C, top) និង radiolabeled nsp9-His6 ត្រូវបានរកឃើញដោយការថតរូបភាពផូស្វ័រ (C, កណ្តាល)។ដោយប្រើប្រូតេអ៊ីនប្រភេទ Wild-type (wt) ជាឯកសារយោង (កំណត់ទៅ 100%) សកម្មភាព NMPylation ដែលទាក់ទង (មធ្យម ± SEM) ត្រូវបានគណនាពីការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបី។(ឃ) មេរោគនៅក្នុងកោសិកាវប្បធម៌ p1 នៃកោសិកា Huh-7 ដែលឆ្លងមេរោគ HCoV-229E ប្រភេទសត្វព្រៃ Huh-7 ហើយពពួក mutants ផ្ទុកការជំនួសអាស៊ីតអាមីណូដែលបានកំណត់ក្នុង nsp9 ត្រូវបានកំណត់ដោយការវិភាគបន្ទះ។គំនូរ RdRp ខ្វះការចម្លង C double mutant DD4823/4AA ត្រូវបានប្រើជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន។
N-terminus នៃ nsp9 (ជាពិសេសមុខតំណែង 1, 2, 3, និង 6) ត្រូវបានអភិរក្សយ៉ាងខ្លាំងក្នុងចំណោមសមាជិកនៃក្រុមរង Orthocoronavirinae (SI appendix, រូបភាព S6) ។ដើម្បីសិក្សាពីតួនាទីដែលអាចកើតមាននៃសំណល់ទាំងនេះនៅក្នុង nsp12-mediated nsp9 NMPylation សំណល់ Asn ពីរជាប់គ្នានៅ N-terminus នៃ nsp9 ត្រូវបានជំនួសដោយ Ala ឬ Ser (តែម្នាក់ឯង ឬរួមបញ្ចូលគ្នា)។បើប្រៀបធៀបជាមួយ nsp9 ប្រភេទព្រៃ ការជំនួស N3825 ជាមួយ Ala ឬ Ser បណ្តាលឱ្យមានការថយចុះច្រើនជាង 2 ដងនៅក្នុង UMPylation ដែលសម្របសម្រួល nsp12 (រូបភាព 5C) ។ស្របជាមួយនឹងការសន្និដ្ឋានរបស់យើងថា NMPylation កើតឡើងនៅ N-terminal primary amine ជំនួសឱ្យខ្សែសង្វាក់ចំហៀងនៃសំណល់ N-terminal យើងបានសង្កេតឃើញសំណល់សំខាន់ៗ NMPylation ជាមួយនឹងការជំនួស N3825A និង N3825S ។គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ប្រសិនបើ Asn ទីពីរត្រូវបានជំនួសដោយ Ala ឬ Ser នោះ nsp9 UMPylation ត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំង (ច្រើនជាង 10 ដង) ខណៈពេលដែលការជំនួស Ala នៅទីតាំង 3, 4, និង 6 មានឥទ្ធិពលតិចតួចលើ nsp9 UMPylation (រូបភាពទី 2 ។ ) ។5C) ។លទ្ធផលស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានទទួលដោយប្រើ ATP, CTP ឬ GTP (SI appendix, រូបភាព S8)។ជារួម ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញពីតួនាទីសំខាន់របស់ N2826 (ទីតាំង 2 ក្នុង nsp9) នៅក្នុង nsp9 NMPylation ។
ដើម្បីទទួលបានភស្តុតាងបន្ថែមនៃទំនាក់ទំនងមុខងាររវាង N-terminus នៃ nsp9 និង NMPylation យើងបានអនុវត្តការតម្រឹមតាមលំដាប់លំដោយច្រើន (MSA) នៃលំដាប់ nsp9 នៃគ្រួសារ Coronavirus (ខុសគ្នារវាងសំណល់ 104 និង 113) (SI Appendix, រូបភាព ស៦)។សរុបមក នៅក្នុងប្រភេទសត្វចំនួន 47 (ដែលគេស្គាល់ និងដាក់បញ្ចូល) នៃ 5 ហ្សែននៃក្រុមរង Orthocoronavirinae ដែលឆ្លងដល់ថនិកសត្វ សត្វស្លាប និងសត្វល្មូនផ្សេងៗគ្នា មានតែសំណល់ចំនួន 8 ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានគេរកឃើញថាមិនប្រែប្រួល។ការផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងទូលំទូលាយបំផុត រួមទាំងការលុប និងការបញ្ចូលត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងវដ្ដរវាងធាតុរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃ nsp9 ដូចដែលបានកំណត់ដោយការសិក្សារចនាសម្ព័ន្ធពីមុន (26 ??28) ។សំណល់អថេរចំនួនប្រាំត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង β strand និងα helix នៃផ្នែក C-terminal នៃ nsp9 ។សំណល់អថេរចំនួនបីបង្កើតបានជាគំនូរ NNE នៃ N terminus នៃ nsp9 ។វាត្រូវបានបង្ហាញថា Asn ទីពីរនៃគំនូរនេះគឺជាសំណល់អថេរតែមួយគត់ដែលត្រូវបានចែករំលែកដោយសម្មតិកម្ម nsp9 នៃមេរោគកង្កែបដែលទាក់ទងឆ្ងាយ ហើយតំណាងឱ្យប្រភេទ Microhyla letovirus 1 នៅក្នុងក្រុមរង Letovirinae នៃ Alphaletovirus ។ការអភិរក្សសំណល់នៅក្នុងធាតុរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំរបស់ nsp9 អាចត្រូវបានសមហេតុផលដោយការពិចារណាលើរចនាសម្ព័ន្ធដើម្បីរក្សាការបត់ ឬលក្ខណៈសម្បត្តិនៃការចង RNA ដែលគេស្គាល់។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ហេតុផលនេះហាក់ដូចជាមិនអនុវត្តចំពោះការអភិរក្ស NNE ទេ ហើយមុននឹងការសិក្សានេះ ធម្មជាតិនៃឧបសគ្គដែលកំណត់ការប្រែប្រួលនៃលំដាប់ tripeptide ត្រូវបានបិទបាំងទាំងស្រុង។
ដើម្បីកំណត់ពីសារៈសំខាន់នៃ nsp9-NMPylation និងការអភិរក្ស NNE ក្នុងការចម្លងមេរោគឆ្លង យើងផលិត HCoV-229E mutants ដែលផ្ទុកការជំនួសតែមួយឬពីរដងនៃសំណល់ nsp9 N-terminal ដែលបង្ហាញថា nsp9 NMPylation មានគ្រោះថ្នាក់នៅក្នុង vitro ។មុនពេលយើងចាប់ផ្តើម យើងព្យាយាមឆ្លើយសំណួរថាតើការជំនួសទាំងនេះ (នៅជិតកន្លែងបំបែក nsp8|9) ប៉ះពាល់ដល់ដំណើរការ proteolytic នៃតំបន់ C-terminal pp1a ដែរឬទេ។សំណុំនៃសំណង់ polyprotein nsp7-11 ដែលមានការជំនួសដែលត្រូវគ្នានៅ N-terminus នៃ nsp9 ត្រូវបានផលិតនៅក្នុង E. coli និងកាត់ជាមួយថ្នាំ Mpro ផ្សំឡើងវិញ។ការបំបែក proteolytic នៃកន្លែងទាំងបួន (រួមទាំងកន្លែងបិទ nsp9) មិនត្រូវបានប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំងដោយការជំនួសដែលបានណែនាំណាមួយឡើយ (SI appendix, Figure S9) ដោយមិនរាប់បញ្ចូលការផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះដែលរំខានដល់ការបោសសំអាត Mpro-mediated nsp8|9 (ឬផ្សេងទៀត) គេហទំព័រ។
កោសិកា Huh-7 ត្រូវបានចម្លងជាមួយ HCoV-229E RNA ប្រវែងហ្សែន ដោយបំប្លែង Ala ឬ Ser ជំនួសនៅក្នុង NNE tripeptides ដែលបានអភិរក្ស (N3825, N3826 និង E3827) នៅស្ថានីយ nsp9 N ដែលបង្ហាញថាការផ្លាស់ប្តូរភាគច្រើនគឺស្លាប់។យើងអាចជួយសង្គ្រោះមេរោគដោយការជំនួស Ser ឬ Ala នៃ N-terminal Asn (N2835A ឬ N2835S) ប៉ុន្តែបានបរាជ័យក្នុងការសង្គ្រោះមេរោគជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរតែមួយ និងពីរដងផ្សេងទៀតនៅក្នុងលំដាប់ NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (រូបភាព 5D) ។
លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថាការចម្លងនៃមេរោគឆ្លងនៅក្នុងវប្បធម៌ជាលិកាត្រូវបានដាក់កម្រិត (ដូចគ្នា ឬស្រដៀងគ្នា) កំណត់ការផ្លាស់ប្តូរធម្មជាតិនៃទីតាំង nsp9 NMPylation នៅក្នុងរាងកាយ និងគាំទ្រតួនាទីសំខាន់នៃការឆ្លើយតបនេះនៅក្នុងវដ្តជីវិតនៃមេរោគឆ្លង។
នៅក្នុងសំណុំចុងក្រោយនៃការពិសោធន៍ យើងផលិត C-terminal His6 ដែលមានស្លាក SARS-CoV-2 nsp12 និង nsp9 និងទម្រង់ mutant ពីរនៃ nsp12 នៅក្នុង E. coli ។សំណល់គេហទំព័រសកម្មនៅក្នុងដែន NiRAN និង RdRp ត្រូវបានប្រើប្រាស់ Ala ជំនួសវិញ (រូបភាព 6A និង SI ឧបសម្ព័ន្ធ តារាង S2) ។K4465 នៅក្នុង SARS-CoV-2 nsp12 ត្រូវគ្នាទៅនឹង K4135 នៅក្នុង HCoV-229E (SI Appendix, Figure S2) ដែលបង្ហាញថាត្រូវបានទាមទារសម្រាប់សកម្មភាព NiRAN និងការចម្លង HCoV-229E (រូបភាព 3D និង E)។សំណល់នេះក៏ត្រូវគ្នាទៅនឹងមេរោគសរសៃឈាម EAV nsp9 K94 សំណល់ដែលត្រូវបានបង្ហាញពីមុនថាចាំបាច់សម្រាប់ NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16) ។ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 6B SARS-CoV-2 nsp12 មានសកម្មភាព UMP transferase ដោយប្រើ nsp9 ជាស្រទាប់ខាងក្រោម ខណៈដែល nsp12_K4465A សកម្មនៃគេហទំព័រ mutant គឺអសកម្ម។ការជំនួសពីរដងនៅក្នុងលំដាប់លក្ខណៈ SDD នៃ RdRp motif C មិនប៉ះពាល់ដល់សកម្មភាព UMP transferase (រូបភាព 6B) ដែលបង្ហាញថាសកម្មភាព RdRp មិនមានឥទ្ធិពលផ្ទាល់នៅក្នុង nsp9 UMPylation ទេ។ទិន្នន័យស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានទទួលដោយប្រើ CTP, GTP និង ATP (SI appendix, រូបភាព S10)។សរុបមក ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា NiRAN-mediated nsp9 NMPylation មានសកម្មភាពអភិរក្សនៅក្នុងមេរោគឆ្លងដែលតំណាងឱ្យប្រភេទផ្សេងៗគ្នានៃក្រុមរងនៃមេរោគ orthocoronavirus ។
SARS-CoV-2 nsp12-mediated NMPylation នៃ nsp9 ។(ក) Coomassie ប្រឡាក់ SDS-polyacrylamide gel បង្ហាញប្រូតេអ៊ីន recombinant ដែលប្រើក្នុងការធ្វើតេស្ត NMPylation ។ក្នុងនាមជាវត្ថុបញ្ជាមួយ ប្រូតេអ៊ីនដែលផ្លាស់ប្តូរជាមួយនឹងការជំនួសកន្លែងសកម្មនៅក្នុងដែន NiRAN (K4465A) និងដែន RdRp (DD5152/3AA) នៃ SARS-CoV-2 nsp12 ត្រូវបានប្រើប្រាស់។លេខរៀងសំណល់គឺផ្អែកលើទីតាំងនៅក្នុង pp1ab ។(ខ) Autoradiograph នៃការរកឃើញ UMPylation ដោយប្រើ nsp9-His6 និង [α-32P]UTP ជាស្រទាប់ខាងក្រោមនៃ nsp12-His6 (ប្រភេទព្រៃ [wt] និង mutant) ។ម៉ាស់ម៉ូលេគុល (គិតជាគីឡូដាល់តោន) នៃប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាកត្រូវបានបង្ហាញនៅខាងឆ្វេង។
ដែន NiRAN ជាទូទៅត្រូវបានអភិរក្សនៅក្នុង Nidovirales (16) ដែលបង្ហាញថាពួកវាបង្កើតប្រតិកម្មអង់ស៊ីមសំខាន់ៗសម្រាប់ការចម្លងមេរោគ Nidovirus ។នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងអាចបញ្ជាក់បានថា ដែន NiRAN នៃមេរោគឆ្លងបានផ្ទេរ NMP (បង្កើតពី NTP) ទៅ nsp9 ដែលជាប្រូតេអ៊ីនចង RNA អាថ៌កំបាំងដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការចម្លងមេរោគ (26?? 29) ដើម្បីកំណត់វាជាគោលដៅធម្មជាតិ និង ដៃគូនៃមេរោគ RTC ។
ដែន NiRAN ចែករំលែកគំនូរលំដាប់ចំនួនបី (AN, BN, និង CN) ដែលផ្ទុកនូវសំណល់តិចតួចបំផុតដែលត្រូវបានអភិរក្សនៅក្នុងគ្រួសារទាំងអស់នៅក្នុងលំដាប់ Nidovirales ប៉ុន្តែមានភាពខុសគ្នាខ្លាំង (8, 16) ។ការសិក្សាថ្មីៗបានបង្ហាញថាពួកវាមានទំនាក់ទំនងតាមរចនាសម្ព័ន្ធទៅនឹងក្រុមគ្រួសារប្រូតេអ៊ីន kinase ដែលមិនមានលក្ខណៈពិសេសច្រើន ដែលដើមឡើយត្រូវបានគេហៅថាគ្រួសារ SelO (17, 19, 22, 30, 31) ។ប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹង SelO មានផ្នត់ kinase ប៉ុន្តែខ្វះសំណល់កន្លែងសកម្មដែលត្រូវបានអភិរក្សជាច្រើននៅក្នុង kinases បុរាណ (22, 32) ។ដោយផ្អែកលើការតំរង់ទិសបញ្ច្រាសនៃម៉ូលេគុល ATP ដែលចងភ្ជាប់ទៅនឹងកន្លែងសកម្ម និងស្ថេរភាពដោយអន្តរកម្មជាក់លាក់ SelO ត្រូវបានគេសន្មត់ថានិងត្រូវបានបញ្ជាក់ជាបន្តបន្ទាប់ដើម្បីផ្ទេរ AMP (ជំនួសឱ្យផូស្វាត) ទៅស្រទាប់ខាងក្រោមប្រូតេអ៊ីន (22) ខណៈដែលប្រូតេអ៊ីន SelO ស្រដៀងនឹងបាក់តេរី YdiU មាន ថ្មីៗនេះត្រូវបានបង្ហាញដើម្បីជំរុញការភ្ជាប់ covalent នៃ UMP ទៅ Tyr និងសំណល់របស់គាត់នៃស្រទាប់ប្រូតេអ៊ីនផ្សេងៗគ្នា (33) ។
ដើម្បីបញ្ជាក់ និងពង្រីកការព្យាករណ៍នៃសំណល់កន្លែងសកម្មដាក់នៃដែនមេរោគ NiRAN យើងបានប្រើវិធីសាស្ត្រគីមីជីវៈ និងហ្សែនបញ្ច្រាស ដើម្បីអនុវត្តការវិភាគការផ្លាស់ប្តូរលើមេរោគ nsp12 (រូបភាព 3D និង E និង SI ឧបសម្ព័ន្ធរូបភាព S3 និងតារាង) S1â ស៤)។ទិន្នន័យបង្ហាញថាការជំនួស HCoV-229E K4135, R4178 និង D4280 ជាមួយ Ala លុបបំបាត់សកម្មភាព NMP transferase ក្នុង vitro និងការចម្លងមេរោគនៅក្នុងវប្បធម៌កោសិកា (រូបភាព 3D និង E និង SI appendices រូបភាព S3) ដែលគាំទ្រវត្តមានរបស់ពួកគេនៅក្នុង NTP γ-phosphate (K4135, R4178) និងការសម្របសម្រួលនៃអ៊ីយ៉ុងលោហៈធាតុសកម្ម (D4280) ។ការជំនួស E4145A នៃ Glu ដែលបានអភិរក្សនៅក្នុងជួរនៃមេរោគសំបុកបក្សីដែលព្យាករណ៍ថានឹងធ្វើឱ្យទីតាំង K4135 (17) មានស្ថេរភាពត្រូវបានបង្ហាញដើម្បីលុបបំបាត់ការចម្លងមេរោគ ប៉ុន្តែគួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើល សកម្មភាពត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុងការធ្វើតេស្ត NMPylation in vitro (រូបភាព 3D និង E និង ឧបសម្ព័ន្ធ SI រូបភាព S3 និងតារាង S1–S4)។ការសង្កេតស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានធ្វើឡើងនៅពេលដែលការជំនួសដែលត្រូវគ្នាត្រូវបានណែនាំនៅក្នុង YdiU homolog នៃ Salmonella typhimurium (E130A) (33) ។សរុបមក ទិន្នន័យទាំងនេះគាំទ្រមុខងារនិយតកម្មនៃសំណល់ដែលបានរក្សាទុកនេះជាជាងមុខងារកាតាលីករ។
ការជំនួសសំណល់ Phe ដែលបានអភិរក្ស (F4281A) នៅក្នុងជួរនៃមេរោគ nestovirus នៅក្នុងដែន HCoV-229E NiRAN (8) បណ្តាលឱ្យមានការថយចុះនៃសកម្មភាព NMPylation នៅក្នុង vitro និងការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃការចម្លងមេរោគនៅក្នុងវប្បធម៌កោសិកា (រូបភាព 3D, E និង SI) ឧបសម្ព័ន្ធរូបភាព S3) ។ទិន្នន័យគឺស្របជាមួយនឹងមុខងារបទប្បញ្ញត្តិសំខាន់ៗនៃសំណល់នេះ ដូចជាសំណល់ Phe motif DFG ដូចគ្នាដែលបានបង្ហាញពីមុន។នៅក្នុង kinases ប្រូតេអ៊ីនបុរាណ វាគឺជាផ្នែកមួយនៃរង្វិលជុំចង Mg2+ និងជួយប្រមូលផ្តុំ និងគ្រប់គ្រងឆ្អឹងខ្នង???ទាមទារសម្រាប់សកម្មភាពកាតាលីករដែលមានប្រសិទ្ធភាព (32, 34)។ការជំនួស Ala និង Arg សម្រាប់សំណល់ K4116 (នៅក្នុងគំនូរ preAN) រៀងៗខ្លួនបានលុបបំបាត់ការចម្លងមេរោគ ហើយតាមការរំពឹងទុក មានផលប៉ះពាល់ផ្សេងៗគ្នាលើសកម្មភាព NMP transferase ក្នុង vitro អាស្រ័យលើខ្សែសង្វាក់ចំហៀងអាស៊ីតអាមីណូដែលបានណែនាំ (រូបភាព 3D និង E និង SI ឧបសម្ព័ន្ធ , រូបភាព S3) ។ទិន្នន័យមុខងារគឺស្របជាមួយនឹងព័ត៌មានរចនាសម្ព័ន្ធដែលបង្ហាញថាសំណល់នេះបានបង្កើតអន្តរកម្មជាមួយ ATP phosphate (17) ។នៅក្នុងដែន NiRAN នៃគ្រួសារមេរោគដែលមានសំបុកផ្សេងទៀត ទីតាំងនៃ HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ត្រូវបានកាន់កាប់ដោយ Lys, Arg ឬ His (8) ដែលបង្ហាញថាការរឹតបន្តឹងមុខងារនៃសំណល់ជាក់លាក់នេះត្រូវបានបន្ធូរបន្ថយ។ការជំនួស D4188A និង D4283A លុបបំបាត់ ឬកាត់បន្ថយសកម្មភាពអង់ស៊ីមយ៉ាងខ្លាំង និងលុបបំបាត់ការចម្លងមេរោគ (រូបភាពទី 3) ។សំណល់ទាំងពីរនេះត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុងភាគច្រើន (ប៉ុន្តែមិនមែនទាំងអស់) មេរោគដែលដាក់សំបុក (8) ដែលបង្ហាញពីមុខងារជាក់លាក់នៃគ្រួសារដ៏សំខាន់ ប៉ុន្តែអាចមិនមែនជាកាតាលីករ។ការជំនួស Ala នៃសំណល់ Lys និង Asp ផ្សេងទៀត (K4113A, D4180A, D4197A និង D4273A) ដែលមិនត្រូវបានអភិរក្សនៅក្នុងគ្រួសារ Coronaviridae ឬ Nestioviridae ផ្សេងទៀត (8) ត្រូវបានគេប្រើជាការគ្រប់គ្រង។ដូចដែលបានរំពឹងទុក ការជំនួសទាំងនេះគឺអាចអត់ឱនបានយ៉ាងច្រើន ជាមួយនឹងការថយចុះបន្តិចនៃសកម្មភាពអង់ស៊ីម និងការចម្លងមេរោគនៅក្នុងករណីមួយចំនួន (រូបភាពទី 3 និងឧបសម្ព័ន្ធ SI រូបភាព S3) ។សរុបមក ទិន្នន័យបំរែបំរួលនៃមេរោគឆ្លងគឺមានភាពស៊ីសង្វាក់គ្នាយ៉ាងខ្លាំងជាមួយនឹងទិន្នន័យហ្សែនដោយខ្លួនឯង និងហ្សែនបញ្ច្រាសនៃ EAV NiRAN-RdRp (16) ដែលក្នុងនោះ EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) សំណល់ K94 (ដែលត្រូវនឹង HCoV-229E K4135) មុខងារសំខាន់ៗ), R124 (ត្រូវគ្នានឹង R4178), D132 (ត្រូវគ្នានឹង D4188), D165 (ត្រូវនឹង D4280), F166 (ត្រូវនឹង F4281) ។លើសពីនេះ ទិន្នន័យ HCoV-229E mutagenesis គឺស្របនឹង និងពង្រីកពីទិន្នន័យហ្សែនបញ្ច្រាស SARS-CoV (16) ដែលបានរាយការណ៍ពីមុន ដូចគ្នានឹងអ្វីដែលបានសង្កេតឃើញសម្រាប់គំនូរ CN ដែលត្រូវគ្នា Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 ។ phenotype បានពិពណ៌នា -F219A និង HCoV-229E_F4281A (រូបភាពទី 3 D និង E និង SI ឧបសម្ព័ន្ធ រូបភាព S3 និងតារាង S1-S4)។
បើប្រៀបធៀបជាមួយ EAV orthologs (16) ដែលមានចំណង់ចំណូលចិត្តច្បាស់លាស់សម្រាប់ UTP និង GTP (នៅក្នុងប្រតិកម្ម NMPylation ដោយខ្លួនឯង) ការសិក្សារបស់យើងបង្ហាញថាដែនមេរោគ NiRAN (តំណាងដោយ HCoV-229E និង SARS-CoV-2) អាចមានប្រសិទ្ធភាព។ បានផ្ទេរ NMPs ទាំងបួន ទោះបីជាមានចំណូលចិត្តបន្តិចសម្រាប់ UMP (រូបភាពទី 1 និងទី 3)។ភាពជាក់លាក់ទាបនៃស្រទាប់ខាងក្រោម NTP ជាក់លាក់គឺស្របជាមួយនឹងរចនាសម្ព័ន្ធ supercomposite SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ដែលបានរាយការណ៍ថ្មីៗនេះ ដែលក្នុងនោះ ADP-Mg2+ ភ្ជាប់ទៅកន្លែងសកម្មរបស់ NiRAN ប៉ុន្តែមិនមែនជាមួយផ្នែក adenine ទេ។ ការបង្កើតអន្តរកម្មជាក់លាក់ (១៧) ។នៅក្នុងការសិក្សារបស់យើង ប្រភេទនៃនុយក្លេអូទីតដែលប្រើក្នុងប្រតិកម្ម NMPylation មិនមានឥទ្ធិពលឌីផេរ៉ង់ស្យែលលើសកម្មភាពនៃប្រូតេអ៊ីន mutant (SI Appendix, Figure S3) ដែលបង្ហាញថាគ្មានសំណល់ទាំងនេះពាក់ព័ន្ធយ៉ាងជិតស្និទ្ធទៅនឹងការចងនៃ nucleobase ជាក់លាក់នោះទេ។មូលដ្ឋានរចនាសម្ព័ន្ធ និងសារៈសំខាន់ជីវសាស្ត្រសក្តានុពលនៃចំណូលចិត្តរួមនៃស្រទាប់ខាងក្រោម NTP ផ្សេងគ្នាដែលបានសង្កេតនៅក្នុងដែន NiRAN នៃមេរោគឆ្លង និងមេរោគសរសៃឈាមនៅតែត្រូវបានសិក្សា។ពួកគេអាចជាការពិត ឬអាចមកពីការកំណត់នៃការសិក្សារៀងៗខ្លួន។នាពេលបច្ចុប្បន្ននេះ វាមិនអាចត្រូវបានគេច្រានចោលថាសកម្មភាព NMPylator សក្តានុពលនៃដែនមេរោគសរសៃឈាមអារទែ NiRAN (បើប្រៀបធៀបទៅនឹងសកម្មភាព NMPylation ដោយខ្លួនឯងដែលបានកំណត់ពីមុន) មានចំណូលចិត្តរួមនៃស្រទាប់ខាងក្រោមផ្សេងគ្នា ដោយគិតគូរពីភាពស្រដៀងគ្នារវាងសរសៃឈាមអាកទែរ និងមេរោគឆ្លង។ ដែន NiRAN គឺនៅដែនកំណត់របស់វា។ការប្រៀបធៀបផ្អែកលើលំដាប់ (១៦) ។បើប្រៀបធៀបជាមួយ pseudokinase SelO ដែលប្រើ Mg2+ ជា cofactor សកម្មភាពនៃមេរោគឆ្លង និងមេរោគសរសៃឈាម NiRAN គឺពឹងផ្អែកលើ Mn2+ (16) (រូបភាពទី 3C និង SI appendix រូបភាព S1) ។ការពឹងផ្អែក Mn2+ និងចំណូលចិត្តជាក់ស្តែងសម្រាប់ UTP គឺជាលក្ខណៈពិសេសមិនធម្មតានៃប្រូតេអ៊ីន NMPylators ហើយថ្មីៗនេះទើបតែត្រូវបានបញ្ជាក់នៅក្នុងប្រូតេអ៊ីន YdiU នៃ Salmonella typhimurium ដែលជំរុញឱ្យ Chaperone UMPylation ប្រូតេអ៊ីនដែលពឹងផ្អែកលើ Mn2+ យ៉ាងតឹងរ៉ឹង ដើម្បីការពារកោសិកាពីការបញ្ចូលភាពតានតឹងនៃកោសិកា ATP ( ៣៣).
ភាពស្រដៀងគ្នានៃរចនាសម្ព័ន្ធដែលបានពិពណ៌នានាពេលថ្មីៗនេះរវាងដែនមេរោគ NiRAN និងប្រូតេអ៊ីន kinases កោសិកា (17, 19) ផ្តល់នូវការគាំទ្របន្ថែមសម្រាប់សមត្ថភាពរបស់ NiRAN ក្នុងការភ្ជាប់ NMP ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀតដែលយើងបានរាយការណ៍នៅក្នុងការសិក្សានេះ។យើងបានផ្តោតលើការស្វែងរករបស់យើងសម្រាប់គោលដៅ NiRAN ដែលអាចកើតមានលើប្រូតេអ៊ីនដែលបានអ៊ិនកូដដោយ HCoV-229E ORF1a ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថាជួយដោយផ្ទាល់ ឬដោយប្រយោលក្នុងការជួយចម្លងដែលបានអ៊ិនកូដ RTC របស់ ORF1b (12, 35) ។ការពិសោធន៍របស់យើងផ្តល់នូវភ័ស្តុតាងបញ្ជាក់សម្រាប់ NMPylation ដ៏មានប្រសិទ្ធភាព និងជាក់លាក់នៃ nsp9 (រូបភាពទី 2) ។ប្រសិនបើប្រូតេអ៊ីនគោលដៅត្រូវបានប្រើប្រាស់ក្នុងម៉ូលេគុលលើសពី 8 ទៅ 10 ដងខ្ពស់ជាងអង់ស៊ីម (nsp12) នោះវាត្រូវបានបញ្ជាក់ថា nsp9 គឺទាំងស្រុង (ម៉ូណូ)NMPized (រូបភាពទី 4)។យើងបានសន្និដ្ឋានថាអន្តរកម្មរវាង nsp12 និង nsp9 គឺមានរយៈពេលខ្លី ហើយនឹងមិនបង្កើតស្មុគស្មាញដែលមានស្ថេរភាពជាមួយ nsp9 ទេ (ក្នុងករណីដែលគ្មានអនុរង RTC ផ្សេងទៀត)។ការសន្និដ្ឋាននេះត្រូវបានគាំទ្រដោយការសិក្សាអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនលើ SARS-CoV proteome (35) ។ការវិភាគ MS បានកំណត់អត្តសញ្ញាណបឋមនៃសំណល់ N-terminal residue នៃ nsp9 ជាគេហទំព័រ NMPylation (SI appendix រូបភាព S5)។ការបង្កើតចំណង phosphoramidate និងក្រុម N-terminal amino group បែងចែកសកម្មភាព NMPylation NiRAN-mediated NMPylation ពីប្រតិកម្ម Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation ដែលជំរុញការបង្កើត O-linked AMP នៅ Ser, Thr, ឬ Tyr residues Peptide adduct ( 22), និង S. typhimurium YdiU បង្កើតជា O-linked (ជាមួយ Tyr) និង N-linked (ជាមួយ His) peptide-UMP adducts ។ព័ត៌មានមានកំណត់ដែលមាននៅលើក្រុមប្រូតេអ៊ីន SelO បង្ហាញថាសមាជិកនៃក្រុមគ្រួសារប្រូតេអ៊ីនដ៏ធំនេះមានភាពខុសប្លែកគ្នាយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងការបង្កើត peptide-NMP adducts ។នេះជាការសង្កេតគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ដែលសមនឹងការសិក្សាបន្ថែមទៀត។
ទិន្នន័យដែលទទួលបានក្នុងការសិក្សានេះបាននាំឱ្យយើងសន្មត់ថា NMPylation នៃ nsp9 ទាមទារ N-terminus ដោយឥតគិតថ្លៃ។នៅក្នុងបរិបទនៃការចម្លងមេរោគ នេះនឹងត្រូវបានផ្តល់ដោយការបោសសំអាត proteolytic នៃកន្លែងដំណើរការ nsp8|nsp9 នៅក្នុង polyprotein pp1a ចម្លងដែលសម្របសម្រួលដោយ Mpro និង pp1ab ។នៅក្នុងមេរោគឆ្លងភាគច្រើន ភាពខុសគ្នារវាងគេហទំព័រជាក់លាក់នេះ (VKLQ|NNEI នៅក្នុង HCoV-229E) និងកន្លែងបំបែកមេរោគ Mpro ផ្សេងទៀតទាំងអស់គឺ Asn (ជាជាងសំណល់តូចមួយផ្សេងទៀតដូចជា Ala, Ser Or Gly) កាន់កាប់ P1â???ទីតាំង (៣៦).ទិន្នន័យការបំបែក peptide ដែលទទួលបានក្នុងការសិក្សាដំបូងបានបង្ហាញថា ប្រសិទ្ធភាពនៃការបំបែកនៃគេហទំព័រ nsp8|nsp9 គឺទាបជាងគេហទំព័រផ្សេងទៀត ដែលបង្ហាញថា 1) គេហទំព័រជាក់លាក់នេះអាចមានតួនាទីនិយតកម្មក្នុងដំណើរការសម្របសម្រួលទាន់ពេលវេលានៃស្ថានីយ C តំបន់ pp1a ឬ 2) តួនាទីនៃ nsp9 N-terminus ដែលបានអភិរក្សពិសេសក្នុងការចម្លងមេរោគ (37) ។ទិន្នន័យរបស់យើង (រូបភាពទី 5A) បានបង្ហាញថាទម្រង់ recombinant នៃ nsp9 ដែលផ្ទុកលំដាប់ N-terminal ពិតប្រាកដត្រូវបាន NMPized ដោយ nsp12 យ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព។លំដាប់ N-terminal flanking ត្រូវបានដកចេញដោយកត្តា Xa (nsp9-His6; SI appendix, Table S1) ឬ Mpro-mediated cleavage (nsp7-11-His6; រូបភាព 5A និង SI appendix, Table S1)។សំខាន់ ប្រូសេស័រដែលមានផ្ទុក nsp9 ដែលមិនកាត់ត nsp7-11-His6 បានបង្ហាញពីភាពធន់នឹង NMPylation នៃ nsp12 ដែលស្របនឹងទិន្នន័យរបស់យើង ដែលបង្ហាញថា adduct nsp9-NMP ត្រូវបានបង្កើតឡើងតាមរយៈ N-terminal primary amine (SI appendix, Figure S5) .ដើម្បីទទួលបានការយល់ដឹងកាន់តែស៊ីជម្រៅអំពីភាពជាក់លាក់នៃស្រទាប់ខាងក្រោម NiRAN បន្ទាប់មកយើងបានផ្តោតលើសំណល់ N-terminal ដែលនៅជាប់គ្នានៃ nsp9 ។អវត្ដមាននៃប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀត ពួកវាមានភាពបត់បែនតាមរចនាសម្ព័ន ការពារពួកវាពីការរកឃើញក្នុងទម្រង់គ្មានស្លាកលេខនៃ nsp9 (26 28, 38) ដែលបង្ហាញពីការប្រែប្រួលធម្មជាតិមានកម្រិតរបស់ពួកគេ នេះគឺដោយសារតែលំដាប់ជាក់លាក់ជាក់លាក់ (មិនទាក់ទងនឹងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ)។ មុខងារនៃបំណែកស្ថានីយ nsp9 N ។ការជំនួស Ala នៃសំណល់ដែលបានអភិរក្សនៅក្នុងតំបន់នេះ (រូបភាព 5C និង D និង SI ឧបសម្ព័ន្ធរូបភាព S8) បង្ហាញថា N3826 គឺចាំបាច់សម្រាប់ nsp9 NMPylation in vitro ខណៈពេលដែលការជំនួស N3825A និង E3827A នាំឱ្យមានការថយចុះនៃ NMPylation ខណៈពេលដែលការជំនួស M3829A និង P383 មិន .ជាក់ស្តែងប៉ះពាល់ដល់ nsp9 NMPylation ។ទោះបីជាការជំនួស N-terminal Asn (N3825A, N3825S) មានឥទ្ធិពលកម្រិតមធ្យមលើ nsp9 NMPylation និងការចម្លងមេរោគនៅក្នុងវប្បធម៌កោសិកា (រូបភាព 5C និង D) ការលុបលំដាប់សំណល់ Asn ពី N-terminal 3825-NN dipeptide បានបង្ហាញឱ្យឃើញថា វាគឺជាការសម្លាប់មេរោគដែលបង្ហាញថាសំណល់ Asn មួយត្រូវបានទាមទារ មុនពេលសំណល់ផ្សេងទៀតនៅ N-terminus និយម Asn ទោះបីជាវាហាក់ដូចជាការជំនួសសំណល់ស្រដៀងគ្នាអាចត្រូវបានអត់ឱនដោយផ្នែកក៏ដោយ (រូបភាព 5B, C, និង D) ។យើងសន្និដ្ឋានថា 3825-NN dipeptide ជាពិសេសសំណល់ N3826 ដែលត្រូវបានអភិរក្ស និងសំខាន់នៅក្នុងជួរនៃមេរោគឆ្លង (SI appendix, Figure S6) ធានានូវការចងត្រឹមត្រូវ និងការតំរង់ទិសនៃ nsp9 N-terminus នៅលើគេហទំព័រសកម្មរបស់ NiRAN ។
ការជំនួស Ala (E3827A) សម្រាប់ Glu ដែលបានអភិរក្សនៃក្រុមរងទាំងអស់រក្សា nsp9 NMPylation នៅក្នុង vitro ប៉ុន្តែមានភាពសាហាវចំពោះមេរោគនៅក្នុងវប្បធម៌កោសិកា (រូបភាព 5C និង D) ដែលបង្ហាញពីមុខងារបន្ថែមនៃសំណល់នេះ ជាឧទាហរណ៍ ក្នុងអន្តរកម្មសំខាន់ៗ (NMPylated ឬមិនបានកែប្រែ ) nsp9 N-terminus និងកត្តាផ្សេងទៀតដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការចម្លងមេរោគ។ការផ្លាស់ប្តូរ Nsp9 មិនប៉ះពាល់ដល់ដំណើរការ proteolytic នៃ nsp9 ឬ nsps ដែលនៅជាប់គ្នាណាមួយ (39) (SI Appendix, Figure S9) ដែលបង្ហាញថា phenotypes ដ៍សាហាវនៃការផ្លាស់ប្តូរ nsp9 ជាច្រើនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញមិនត្រូវបានបង្កឡើងដោយ dysregulation នៃ C proteolytic process-terminal area pp1a នោះទេ។ .
ទិន្នន័យខាងលើផ្តល់នូវភស្តុតាងដែលថាបន្ទាប់ពីការព្យាបាលដោយការសម្របសម្រួល Mpro នៃកន្លែងបំបែក nsp8|9 នៅក្នុង pp1a/pp1ab N-terminus នៃ nsp9 អាចត្រូវបាន UMPylated (ឬកែប្រែផ្នែកខ្លះជាមួយ NMP មួយផ្សេងទៀត)។លើសពីនេះ ការអភិរក្សដ៏ល្អឥតខ្ចោះនៃ N-terminus នៃ nsp9 (រួមទាំងសំណល់ Asn ឯកវចនៈ និងអថេរនៅក្នុងគ្រួសារមេរោគ) និងទិន្នន័យហ្សែនបញ្ច្រាសដែលទទួលបានក្នុងការសិក្សានេះ (រូបភាព 3E និង 5D) បាននាំឱ្យយើងសន្និដ្ឋានថា nsp9 NMPylation ដែលបានពិពណ៌នា មានទំនាក់ទំនងជីវសាស្រ្ត និងចាំបាច់សម្រាប់ការចម្លងមេរោគឆ្លង។ផលវិបាកមុខងារនៃការកែប្រែនេះនៅតែត្រូវបានសិក្សា ជាឧទាហរណ៍ ទាក់ទងនឹងសកម្មភាពភ្ជាប់ RNA (2628) ដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (មិនជាក់លាក់) ។N-terminal NMPylation ក៏អាចប៉ះពាល់ដល់អន្តរកម្មនៃ nsp9 ជាមួយស្រទាប់ខាងក្រោមប្រូតេអ៊ីន ឬ RNA ឬការបង្កើតការផ្គុំកម្រិតបួនផ្សេងគ្នា។ទាំងនេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងការសិក្សារចនាសម្ព័ន្ធ និងត្រូវបានបញ្ជាក់ថាមានមុខងារទាក់ទងទៅនឹងការចម្លងមេរោគឆ្លងមេរោគ ទោះបីជាពិសេសនៅក្នុងករណីនៃការកែប្រែនេះ (26- â 29, 40) ។
ទោះបីជាភាពជាក់លាក់គោលដៅនៃដែនមេរោគ NiRAN នៅតែត្រូវកំណត់លក្ខណៈលម្អិតបន្ថែមទៀតក៏ដោយ ទិន្នន័យរបស់យើងបង្ហាញថាភាពជាក់លាក់គោលដៅប្រូតេអ៊ីននៃដែនមេរោគ NiRAN គឺតូចចង្អៀតណាស់។ទោះបីជាការអភិរក្សសំណល់នៃគេហទំព័រសកម្មសំខាន់ៗ (8, 16) នៅក្នុងដែន NiRAN នៃគ្រួសារ nidovirus ទាំងអស់គាំទ្រយ៉ាងខ្លាំងចំពោះសកម្មភាពរបស់ NMPylator ដែលបានរក្សាទុកប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះក៏ដោយ អត្តសញ្ញាណនៃសំណល់ថង់ដាក់ស្រទាប់ខាងក្រោមនៃដែននេះ ការអភិរក្ស និងការអភិរក្សនៅតែត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈ ហើយអាចខុសគ្នារវាងគ្រួសារផ្សេងគ្នានៃគោលបំណង Nidovirales ។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ គោលដៅពាក់ព័ន្ធនៃមេរោគដែលដាក់ក្នុងសំបុកផ្សេងទៀតមិនទាន់ត្រូវបានកំណត់នៅឡើយ។ពួកវាអាចជា orthologs ដាច់ស្រយាលនៃ nsp9 ឬប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀត ពីព្រោះលំដាប់នៅខាងក្រៅដែនចម្លងទាំង 5 ដែលជាទូទៅត្រូវបានអភិរក្សនៅក្នុងមេរោគដែលមានសំបុកគឺមិនសូវត្រូវបានអភិរក្សទេ (8) រួមទាំងអារេហ្សែនរវាង Mpro និង NiRAN ក្នុងចំណោមពួកគេ nsp9 មានទីតាំងនៅ វីរុសកូរ៉ូណា។
លើសពីនេះ យើងមិនអាចបដិសេធលទ្ធភាពដែលដែន NiRAN មានគោលដៅបន្ថែម (រួមទាំងកោសិកា) នោះទេ។ក្នុងករណីនេះវាមានតម្លៃក្នុងការនិយាយថាភាពដូចគ្នានៃបាក់តេរីនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីន NMPylators (NMPylators) (30, 31) ហាក់ដូចជាមាន "និយតករមេ"?NMP កែប្រែភាពខុសគ្នានៃប្រូតេអ៊ីនកោសិកាដើម្បីគ្រប់គ្រង ឬលុបបំបាត់សកម្មភាពខាងក្រោមរបស់ពួកគេ ដោយហេតុនេះដើរតួនាទីក្នុងដំណើរការជីវសាស្រ្តជាច្រើនដូចជា ការឆ្លើយតបភាពតានតឹងកោសិកា និង redox homeostasis (22, 33) ។
នៅក្នុងការសិក្សានេះ (រូបភាពទី 2 និងទី 4 និងឧបសម្ព័ន្ធ SI រូបភាព S3 និង S5) យើងអាចបង្ហាញថា nsp12 បានផ្ទេរផ្នែក UMP (NMP) ទៅទីតាំងតែមួយ (អភិរក្ស) នៅក្នុង nsp9 ខណៈពេលដែលប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀតមិនត្រូវបានកែប្រែនៅក្នុង ប្រើក្រោមលក្ខខណ្ឌ ភាពជាក់លាក់នៃស្រទាប់ខាងក្រោមដែលបានកំណត់យ៉ាងល្អ (ជាជាងរលុង) ត្រូវបានគាំទ្រ។ស្របជាមួយនេះ បើប្រៀបធៀបជាមួយ N-terminal nsp9 NMPylation សកម្មភាព NMPylation ផ្ទាល់របស់ nsp12 មានកម្រិតទាបណាស់ ការរកឃើញរបស់វាទាមទារពេលវេលានៃការប៉ះពាល់ autoradiography យូរជាង ហើយការកើនឡើង 10 ដងនៃកំហាប់ nsp12 ត្រូវបានប្រើ។លើសពីនេះទៀតការវិភាគ MS របស់យើងបានបរាជ័យក្នុងការផ្តល់ភស្តុតាងសម្រាប់ NMPylation នៃ nsp12 ដែលបង្ហាញថា NiRAN domain self-NMPylation គឺជា (ល្អបំផុត) ជាសកម្មភាពបន្ទាប់បន្សំ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយវាគួរតែត្រូវបានកត់សម្គាល់ថាការសិក្សាផ្សេងទៀតបានផ្តល់ភស្តុតាងបឋមដែលថាស្ថានភាព AMPylation ដោយខ្លួនឯងនៃ NMPylator បាក់តេរីអាចគ្រប់គ្រងសកម្មភាព NMPylation របស់ពួកគេនៅលើស្រទាប់ខាងក្រោមប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀត (22, 33) ។ដូច្នេះ ការស្រាវជ្រាវបន្ថែមគឺត្រូវការជាចាំបាច់ដើម្បីស៊ើបអង្កេតពីផលប៉ះពាល់មុខងារដែលអាចកើតមាននៃសកម្មភាព NMPylation ដោយខ្លួនឯងដែលបានរាយការណ៍សម្រាប់ EAV nsp9 (16) និងមេរោគ nsp12 (ការសិក្សានេះ) រួមទាំងឥទ្ធិពលដូច chaperone ដែលបានស្នើឡើងលើការបត់នៃ C-terminal RdRp domain ( ១៦)។
ពីមុនសម្មតិកម្មជាច្រើនទាក់ទងនឹងមុខងារខាងក្រោមដែលអាចកើតមាននៃដែន nidoviral NiRAN ត្រូវបានគេពិចារណា រួមទាំង RNA ligase, RNA -capped guanylate transferase និងសកម្មភាពបឋមប្រូតេអ៊ីន (16) ប៉ុន្តែគ្មាននរណាម្នាក់ក្នុងចំណោមពួកវាត្រូវគ្នាជាមួយនឹងមុខងារខាងក្រោមដែលមាននោះទេ។ព័ត៌មានដែលទទួលបានក្នុងមុខតំណែងខាងក្រោមគឺពិតជាពេលវេលាដូចគ្នាដោយមិនធ្វើការសន្មត់បន្ថែម។ទិន្នន័យដែលទទួលបានក្នុងការសិក្សានេះគឺស្របបំផុតជាមួយ (ប៉ុន្តែមិនអាចបញ្ជាក់បាន) ថាដែន NiRAN ពាក់ព័ន្ធនឹងការចាប់ផ្តើមនៃការសំយោគ RNA ដែលបណ្តាលមកពីប្រូតេអ៊ីន។វាត្រូវបានគេជឿថាពីមុនមុខងារនៃដែន NiRAN ក្នុង 5 ??²-RNA capping ឬប្រតិកម្ម RNA ligation មិនត្រូវបានប៉ះពាល់ដោយទាំងនេះ និងការគាំទ្រទិន្នន័យផ្សេងទៀតទេ។ដូច្នេះ ជាឧទាហរណ៍ គេហទំព័រសកម្មរបស់ NiRAN ត្រូវបានចាត់ទុកថាពាក់ព័ន្ធនឹង Asp ដែលបានអភិរក្សជាមូលដ្ឋានទូទៅ (D252 ក្នុង Pseudomonas syringae SelO; D4271 ក្នុង HCoV-229E pp1ab; D208 នៅក្នុង SARS-CoV-2 nsp12) (SI ឧបសម្ព័ន្ធ រូបទី 2 )S2) (17, 22, 33) ខណៈពេលដែលកាតាលីករនៅក្នុង ATP-dependent RNA ligase និង RNA capping enzyme ត្រូវបានអនុវត្តដោយអង់ស៊ីម covalent-(lysyl-N)-NMP intermediate ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងសំណល់ Lys ដែលមិនផ្លាស់ប្តូរ ( ៤១).លើសពីនេះ ភាពជាក់លាក់តាមលំដាប់លំដោយដ៏គួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃមេរោគ NiRAN សម្រាប់គោលដៅប្រូតេអ៊ីនដែលបានរក្សាទុក និងភាពជាក់លាក់នៃការបន្ធូរបន្ថយសម្រាប់ស្រទាប់ខាងក្រោម NTP (ចូលចិត្ត UTP) ប្រឆាំងទៅនឹងអង់ស៊ីមបំប្លែង NiRAN ឬមុខងារដូច RNA ligase ។
ជាក់ស្តែង ការងារបន្ថែមជាច្រើនគឺត្រូវការជាចាំបាច់ដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់ ហើយប្រសិនបើបង្ហាញឱ្យឃើញ លម្អិតអំពីតួនាទីដែលអាចកើតមាននៃ nsp9-UMP (nsp9-NMP) ក្នុងការសំយោគ RNA ដែលបណ្តាលមកពីប្រូតេអ៊ីន ដែលនឹងភ្ជាប់របាយការណ៍គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ជាច្រើន ប៉ុន្តែ (រហូតមកដល់ពេលនេះ) បានរាយការណ៍ពីមុន។ .ការសង្កេតដាច់ដោយឡែក។ជាឧទាហរណ៍ វាត្រូវបានគេកំណត់ថាចុងបញ្ចប់នៃ RNA អវិជ្ជមាននៃមេរោគឆ្លងចាប់ផ្តើមដោយខ្សែ oligo (U) (42, 43) ។ការសង្កេតនេះគឺស្របជាមួយនឹងគំនិតដែលថាការសំយោគនៃ RNA ខ្សែអវិជ្ជមានត្រូវបានផ្តួចផ្តើមដោយការចងទម្រង់ UMPylated នៃ nsp9 ទៅនឹងកន្ទុយ poly(A) (កេះ) ដែលអាចត្រូវបានផ្សព្វផ្សាយដោយការចង RNA របស់វា សកម្មភាព និង/ឬអន្តរកម្មជាមួយ ប្រូតេអ៊ីន RTC ផ្សេងទៀត។ផ្នែក UMP ដែលផ្តល់ដោយ nsp9 បន្ទាប់មកអាចត្រូវបានប្រើជា "primer" សម្រាប់ nsp7/8/nsp12-mediated oligouridylation ដោយប្រើកន្ទុយ 3??²-poly(A) នៅក្នុងហ្សែន RNA ឬលំដាប់ដែលមាន oligo (A) ផ្សេងទៀត បម្រើជាគំរូមួយ ស្រដៀងទៅនឹងយន្តការដែលបានបង្កើតឡើងសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីន ភីកខនណា វីភីជី (44)។ចុះបើសំណើនោះគឺជា “មិនមែនជាបទដ្ឋាន”????ការចាប់ផ្តើមនៃការសំយោគ RNA អវិជ្ជមាន (ដែលបណ្ដាលមកពីប្រូតេអ៊ីន) ផ្តល់នូវតំណភ្ជាប់ទៅនឹងការសង្កេត ដែលបង្ហាញថា ខ្សែ RNA អវិជ្ជមាននៃមេរោគឆ្លងមាន UMP (ជំនួសឱ្យ UTP) នៅចុងបញ្ចប់របស់វា (42) ដែលត្រូវបានចាត់ទុកថាបង្ហាញថា អាស៊ីត nucleic Dicer បំបែកចុង phosphorylated ដោយ endonuclease ដែលមិនស្គាល់ uridine-specific ។ប្រសិនបើត្រូវបានបញ្ជាក់ សកម្មភាព hydrolytic អាស៊ីត nucleic នេះអាចជួយបញ្ចេញទម្រង់ oligomeric UMPylated នៃ nsp9 ពីចុង 5 ² នៃខ្សែអវិជ្ជមានដែលចាប់ផ្តើម។តួនាទីដែលអាចកើតមាននៃ nsp9 ក្នុងការបង្កើតប្រូតេអ៊ីនក៏ស្របជាមួយនឹងការសិក្សាហ្សែនបញ្ច្រាសពីមុន ដែលបានបង្ហាញថា nsp9 (និង nsp8) ធ្វើអន្តរកម្មយ៉ាងធ្ងន់ធ្ងរ និងជាពិសេសជាមួយធាតុ RNA ដែលត្រូវបានអភិរក្សនៅជិតចុង 3 នៃហ្សែនមេរោគ។៤៥).យោងតាមរបាយការណ៍នេះ ការសង្កេតពីមុនទាំងនេះ ឥឡូវនេះអាចត្រូវបានពិនិត្យឡើងវិញ និងពង្រីកតាមរយៈការស្រាវជ្រាវបន្ថែមទៀត។
សរុបមក ទិន្នន័យរបស់យើងបានកំណត់សកម្មភាពជាក់លាក់នៃស្លាកអង់ស៊ីមមេរោគដែលមានកម្មសិទ្ធិភ្ជាប់ទៅ RdRp នៅស្ថានីយ N ។នៅក្នុងមេរោគឆ្លង សកម្មភាព UMPylator/NMPylator ដែលសម្រុះសម្រួល NiRAN ដែលទើបរកឃើញនេះ ត្រូវបានប្រើដើម្បីពឹងផ្អែកលើ Mn2+ និងសំណល់ Asn ដែលនៅជាប់គ្នា ហើយបណ្តាលឱ្យមានការបង្កើតចំណង phosphoramidate (ថាមពលទាប) ជាមួយនឹង N-terminal primary amine ។តាមរយៈការបំបែកដោយ Mpro-mediated នៅកន្លែង cleavage nsp8|9 គោលដៅ nsp9 អាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ NMPylation ដែលបង្ហាញពីការភ្ជាប់មុខងាររវាង protease និង NiRAN domain ដែលលាតសន្ធឹងដល់ RdRp ។ការអភិរក្សសំណល់សំខាន់ៗនៅក្នុងគេហទំព័រសកម្ម nsp12 NiRAN និងគោលដៅ nsp9 រួមជាមួយនឹងទិន្នន័យដែលទទួលបានពីមេរោគឆ្លងពីររួមទាំង SARS-CoV-2 ផ្តល់នូវភស្តុតាងរឹងមាំដែលថា nsp9 NMPylation គឺជាមេរោគឆ្លង លក្ខណៈពិសេសអភិរក្សក៏ជាជំហានសំខាន់ក្នុងការចម្លងមេរោគផងដែរ។ទិន្នន័យដែលមាននាំឱ្យយើងសន្និដ្ឋានថាតួនាទីជាក់លាក់នៃទម្រង់ NMPylated នៃ nsp9 ក្នុងការសំយោគ RNA ដែលបង្កឡើងដោយប្រូតេអ៊ីន គឺជាសេណារីយ៉ូសមហេតុផលសម្រាប់មេរោគឆ្លង និងមេរោគផ្សេងទៀតដែលដាក់ក្នុងសំបុក ហើយ NiRAN ក៏អាចកំណត់គោលដៅប្រូតេអ៊ីនដែលមិនស្គាល់អត្តសញ្ញាណផ្សេងទៀតផងដែរ។គ្រប់គ្រងមេរោគ។អន្តរកម្មម្ចាស់ផ្ទះ។ប្រសិនបើត្រូវបានបញ្ជាក់ ការជាប់ពាក់ព័ន្ធនៃប្រូតេអ៊ីនបឋមនៅក្នុងការសំយោគ RNA មេរោគនឹងបង្កើនភាពជាប់ទាក់ទងគ្នានៃដែន Mpro/3CLpro និង RdRp រវាងមេរោគដែលបានរកឃើញពីមុន និងក្រុម super-like picornavirus (9) ដែលឥឡូវនេះត្រូវបានបង្រួបបង្រួមនៅក្នុង Pisonivirites ដែលបានបង្កើតឡើងថ្មីៗនេះ ( 46) នៅក្នុងប្រភេទ។
ទិន្នន័យរបស់យើងក៏បង្ហាញផងដែរថាសកម្មភាពអង់ស៊ីមជាមូលដ្ឋាន ជ្រើសរើស និងអភិរក្សដែលបានកំណត់នៅក្នុងការសិក្សានេះអាចត្រូវបានប្រើជាគោលដៅសម្រាប់ថ្នាំប្រឆាំងមេរោគ។សមាសធាតុដែលរំខានដល់ការចង (និងការកែប្រែជាបន្តបន្ទាប់) នៃ nsp9 N-terminus ដែលបានអភិរក្សនៅក្នុងទីតាំងសកម្មរបស់ NiRAN អាចត្រូវបានបង្កើតឡើងជាថ្នាំប្រឆាំងមេរោគដ៏មានប្រសិទ្ធភាព និងអាចប្រើប្រាស់បាន សមរម្យសម្រាប់ការព្យាបាលនៃមេរោគឆ្លងសត្វ និងមនុស្សពីការឆ្លងមេរោគ (រង) ប្រភេទផ្សេងៗគ្នា។ រួមទាំង SARS-CoV-2 និងរោគសញ្ញាផ្លូវដង្ហើមមជ្ឈិមបូព៌ា។
លំដាប់នៃការសរសេរកូដនៃប្រូតេអ៊ីនមេរោគដែលផលិតក្នុងការសិក្សានេះត្រូវបានពង្រីកដោយ RT-PCR ដោយប្រើ RNA ដាច់ដោយឡែកពី Huh-7 ដែលឆ្លងមេរោគ HCoV-229E ឬ Vero E6 ដែលឆ្លងមេរោគ SARS-CoV-2 ហើយបញ្ចូលដោយប្រើនីតិវិធីក្លូនស្តង់ដារ។pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) ឬ pASK3-Ub-CHis6 (47) expression vector (SI Appendix, Tables S1 និង S2) ។ការជំនួស codon តែមួយត្រូវបានណែនាំដោយ PCR-based mutagenesis (48) ។ដើម្បីផលិតប្រូតេអ៊ីនបញ្ចូលគ្នា MBP កោសិកា E. coli TB1 ត្រូវបានបំប្លែងជាមួយនឹងសំណង់ pMAL-c2 plasmid ដែលសមស្រប (SI appendix, Table S1)។ប្រូតេអ៊ីន fusion ត្រូវបានបន្សុតដោយ amylose affinity chromatography និងកាត់ដោយកត្តា Xa ។ក្រោយមកទៀត ប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាក His6 ស្ថានីយ C ត្រូវបានបន្សុតដោយ Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (49)។ដើម្បីផលិតប្រូតេអ៊ីន ubiquitin fusion កោសិកា E. coli TB1 បានប្រើ pASK3-Ub-CHis6 plasmid construct (SI Appendix, Tables S1 និង S2) និងការអ៊ិនកូដ pCGI plasmid DNA នៃ ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1)។ការផ្លាស់ប្តូរ (47) ។ប្រូតេអ៊ីន C-terminal His6-tagged coronavirus ត្រូវបានបន្សុតដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (50)។
ការធ្វើតេស្ត NMPylation ដោយខ្លួនឯងនៃ HCoV-229E nsp12-His6 ត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុង EAV nsp9 (16) ។និយាយឱ្យខ្លី nsp12-His6 (0.5 µM) មាន 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 μM buffer NTP និង 0.17 µM ដែលបានបញ្ជាក់ត្រូវគ្នា [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) នៅ 30 °C រយៈពេល 30 នាទី។នៅក្នុងការវាយតម្លៃ NMPylation (ស្តង់ដារ) ផ្សេងទៀតនៃ nsp12-mediated nsp9 NMPylation លក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មត្រូវបានកែតម្រូវដូចខាងក្រោមៈ nsp12-His6 (0.05 µM) និង nsp9-His6 (4 µM) នៅក្នុងវត្តមាននៃ 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) ។ ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM បានចង្អុលបង្ហាញ NTP, និង 0.17 µM ត្រូវគ្នា [α32-P]NTP ។បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 30 អង្សាសេ គំរូប្រតិកម្មត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាជាមួយសតិបណ្ដោះអាសន្នគំរូ SDS-PAGE: 62.5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol និង 0.005% ខៀវ។ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានបញ្ចេញដោយកំដៅនៅ 90 ° C រយៈពេល 5 នាទីហើយបំបែកដោយ 12% SDS-PAGE ។ជែលត្រូវបានជួសជុល និងប្រឡាក់ជាមួយនឹងដំណោះស្រាយ Coomassie Brilliant Blue (40% methanol, 10% acetic acid, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250) ផ្លាស់ប្តូរពណ៌ និងប៉ះពាល់ទៅនឹងអេក្រង់រូបភាព phosphorescent រយៈពេល 20 ម៉ោង (ដើម្បីរកឃើញ nsp12 ពី NMPylation) ឬ (អតិបរមា) 2 ម៉ោង (ដើម្បីវាយតម្លៃ nsp9 NMPylation) ។រូបភាព Typhoon 9200 (GE Healthcare) ត្រូវបានប្រើដើម្បីស្កេនអេក្រង់ ហើយ ImageJ ត្រូវបានប្រើដើម្បីវិភាគអាំងតង់ស៊ីតេនៃសញ្ញា។
សម្រាប់ការវិភាគ MS 1 µM nsp12-His6 និង 10 µM nsp9 (ដោយគ្មានស្លាក hexahistidine) ត្រូវបានប្រើក្នុងការវិភាគ NMPylation (SI appendix, Table S1) និងការកើនឡើងកំហាប់នៃ 500 µM UTP និង GTP ត្រូវបានប្រើប្រាស់។អាស្រ័យលើការផ្តោតអារម្មណ៍ និងគុណភាពប្រូតេអ៊ីនដែលរំពឹងទុករបស់ពួកគេ ប្រព័ន្ធ Waters ACQUITY H-Class HPLC ដែលបំពាក់ដោយជួរឈរ MassPrep (Waters) ត្រូវបានប្រើដើម្បីរំលាយប្រូតេអ៊ីនពី 1 ទៅ 10 µL នៃដំណោះស្រាយប្រូតេអ៊ីននៅលើអ៊ីនធឺណិត។ប្រូតេអ៊ីន desalted ត្រូវបាន eluted ចូលទៅក្នុងប្រភព electrospray ion នៃ Synapt G2Si mass spectrometer (Waters) តាមរយៈជម្រាលខាងក្រោមនៃ buffer A (water/0.05% formic acid) និង buffer B (acetonitrile/0.045% formic acid) ហើយសីតុណ្ហភាពជួរឈរគឺ 60 ° C និងអត្រាលំហូរ 0.1 mL/min: elution isocratically ជាមួយ 5% A សម្រាប់ 2 នាទី បន្ទាប់មកជម្រាលលីនេអ៊ែរទៅ 95% B ក្នុងរយៈពេល 8 នាទី និងរក្សា 95% B សម្រាប់ 4 នាទីទៀត។
អ៊ីយ៉ុងវិជ្ជមានដែលមានជួរម៉ាស់ពី 500 ទៅ 5000 m/z ត្រូវបានរកឃើញ។Glu-fibrinopeptide B ត្រូវបានវាស់ជារៀងរាល់ 45 វិនាទីសម្រាប់ការកែរង្វាស់ម៉ាស់ដោយស្វ័យប្រវត្តិ។ប្រើកម្មវិធីឧបករណ៍ MassLynx ជាមួយនឹងផ្នែកបន្ថែម MaxEnt1 ដើម្បីផ្ដាច់វិសាលគមមធ្យម បន្ទាប់ពីកាត់ខ្សែបន្ទាត់មូលដ្ឋាន និងធ្វើឱ្យរលូន។
UMPylated HCoV-229E nsp9 ត្រូវបានរំលាយដោយបន្ថែម trypsin ដែលបានកែប្រែកម្រិតលំដាប់ (Serva) និង incubed មួយយប់នៅ 37 °C។ជួរឈរបង្វិល Chromabond C18WP (លេខផ្នែក 730522; Macerey-Nagel) ត្រូវបានប្រើដើម្បីបំបាត់ និងប្រមូលផ្តុំ peptides ។ទីបំផុត peptide ត្រូវបានរំលាយក្នុងទឹក 25 µL ដែលមាន 5% acetonitrile និង 0.1% អាស៊ីត formic ។
សំណាកត្រូវបានវិភាគដោយ MS ដោយប្រើឧបករណ៍វាស់ស្ទង់ម៉ាស់ Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific)។ប្រព័ន្ធ nanoâ HPLC ចុងក្រោយ (Dionex) បំពាក់ដោយឧបករណ៍ភ្ជាប់ចុងផ្ទាល់ខ្លួន 50 សង់ទីម៉ែត្រ??75 μm C18 RP column packed with 2.4 μm magnetic beads (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) ភ្ជាប់ទៅម៉ាស់ spectrometer តាមអ៊ីនធឺណិតតាមរយៈប្រភព Proxeon nanospray;ចាក់ 6 µL នៃដំណោះស្រាយការរំលាយអាហារ trypsin ទៅក្នុងអង្កត់ផ្ចិតខាងក្នុង 300 µm × ??1 សង់ទីម៉ែត្រ C18 PepMap ជួរឈរមុនប្រមូលផ្តុំ (Thermo Scientific) ។ដោយប្រើទឹក/0.05% អាស៊ីត formic ជាសារធាតុរំលាយ គំរូត្រូវបានជាប់ដោយស្វ័យប្រវត្តិ និង desalinated ក្នុងអត្រាលំហូរ 6 µL/min ។
ជម្រាលខាងក្រោមនៃទឹក / 0.05% អាស៊ីត formic (សារធាតុរំលាយ A) និង 80% acetonitrile / 0.045% អាស៊ីត formic (សារធាតុរំលាយ B) ត្រូវបានប្រើដើម្បីសម្រេចបានការបំបែកនៃ tryptic peptides នៅអត្រាលំហូរ 300 nL / នាទី: 4% B សម្រាប់ 5 នាទីបន្ទាប់មក 30 A ជម្រាលលីនេអ៊ែរទៅ 45% B ក្នុងរយៈពេលប៉ុន្មាននាទី ហើយលីនេអ៊ែរកើនឡើងដល់ 95% សារធាតុរំលាយ B ក្នុងរយៈពេល 5 នាទី។ភ្ជាប់ជួរឈរ chromatographic ទៅដែកអ៊ីណុក nano-emitter (Proxeon) ហើយបាញ់វត្ថុរាវដោយផ្ទាល់ទៅកាន់ capillary ដែលគេឱ្យឈ្មោះថា mass spectrometer ដោយប្រើសក្តានុពលនៃ 2,300 V. ការស្កែនស្ទង់ជាមួយនឹងដំណោះស្រាយ 60,000 នៅក្នុងឧបករណ៍វិភាគម៉ាស់ Orbitrap ត្រូវបានភ្ជាប់។ ជាមួយនឹងការស្កែន MS/MS ទិន្នន័យយ៉ាងតិចបី ដោយមិនរាប់បញ្ចូលជាលក្ខណៈថាមវន្តក្នុងរយៈពេល 30 វិនាទី ដោយប្រើការប៉ះទង្គិចគ្នានៃអន្ទាក់លីនេអ៊ែរដែលបណ្តាលឱ្យមានការបែកបាក់គ្នាឬការបំបែកការប៉ះទង្គិចថាមពលខ្ពស់ជាងរួមបញ្ចូលគ្នាជាមួយនឹងការរកឃើញគន្លង ដំណោះស្រាយគឺ 7,500 ។
ពេលវេលាបង្ហោះ៖ ថ្ងៃទី ០៣ ខែសីហា ឆ្នាំ ២០២១